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gRNA的设计原则和常见问题

作者:Magigen

在CRISPR Cas9基因编辑中,gRNA的设计对实验的成功影响很大。CRISPR Cas9蛋白在向导RNA,gRNA的指引下,靶向目的基因,并形成双链DNA断裂DSB。由于DSB的不完全修复而产生插入和缺失indels,引起移码突变,导致终止密码子提前,实现编码基因敲除的目的。但是,很多人在设计gRNA的时候会遇到很多困难。针对一些常见的gRNA设计的问题,美格君就和大家一起讨论。

gRNA设计常见问题:

一. 通常在利用CRISPR Cas9系统敲除目标基因的时候选用的是单gRNA?还是双gRNA?它们两者有什么不同?

从理论上来说,单gRNA只能靶向基因的1个位点,敲除的转录本数量有限,脱靶率比较高;而双gRNA可以在很大程度上解决这两个问题,也能实现较大的基因片段敲除,因此双gRNA载体的敲除效果会比单gRNA载体好。但是在实际操作中,还要具体情况具体分析,提前制定合适的实验方案,才能在最少的预算中得到想要的实验结果。


二.   gRNA设计规则有哪些?

设计gRNA时需要考虑很多因素,其中有三个必须要遵守的规则:

1. gRNA的序列特异性要足够强;

2. gRNA序列要尽量覆盖较多的转录本;

3. 避免编码氨基酸的靶向区域过于接近蛋白质的N端或C端。


三. 常用的gRNA设计工具有哪些?

一个好的gRNA设计软件可以大幅提高我们的工作效率,减少试错成本。市场上有很多gRNA设计软件,其中张峰实验室的sgRNA设计网站是一个很好的选择。


四. 如何提高gRNA的打靶效率?

提高gRNA打靶效率的方法有很多, 这包括:

1. 优化从gRNA的序列

2. 改变gRNA载体的传递方式,

3. 增加gRNA的数量等等。

提高gRNA的打靶效率要结合具体情况进行优化处理。


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