CRISPR基因编辑技术设计重要事项和关键

作者：Magigen

CRISPR技术是非常好的编辑基因工具，但是需要精心规划才能达到期望的结果。

如何更好的使用CRISPR基因编辑技术？

CRISPR设计的重要事项和关键

**，选择你希望引入的编辑类型，是小的插入缺失InDel？还是特定改变？

小的插入缺失InDel最常用于破坏基因的蛋白编码能力，在CRISPR Cas9蛋白酶切割dsDNA后，非同源末端连接NHEJ容易出错的性质往往会引入移码突变。特定改变则是插入表位或荧光标记，或引入特定突变，必须依赖同源重组（HR）通过外源性模板来修复dsDNA断裂。

如果想创建小的插入缺失，任何蛋白上都有许多可能的靶位点。在使用化脓性链球菌（S. pyogenes）的Cas9蛋白的收，潜在的靶位点是[5’-20nt-NGG]和[5’-CCN-20nt]。因为它同样高效地靶定DNA的编码或非编码链。**靶定蛋白编码区的N端，而不是C端，因为它出现在越上游，就越有可能创建出一个真正无效的等位基因。不过，在用同源重组修复时，靶位点的选择就有更多的限制；当切割位点距离修复模板的近端>30 nt时，效率急剧下降。

第二，确定靶序列，减少脱靶效应

设计sgRNA中关键的一步是避免CRISPR Cas9的脱靶效应。目前，已经有了一些控制脱靶效应的规则，并写入了的开发设计工具。利用生物信息学工具能确定表现出**的序列独特性的基因组位点。这些工具软件包括张锋实验室和Michael Boutros实验室的工具软件。

此外，如何改善着靶活性，目前还知之甚少。我们似乎不可能完全预测到最特异、最具活性的CRISPR，因此，最重要的是，根据经验检测多个不同的CRISPR，以确定着靶效果和脱靶程度。

减少CRISPR技术脱靶效应的一种方法是使用两条sgRNA以及Cas9的“切口酶”版本。这种方法有助于提高特异性，从而减少脱靶的dsDNA断裂。不过，此方法的缺点在于需要两个靶位点，这意味着一些特定位置不适合创建dsDNA断裂。当然，如果可能的话，这是基因编辑的首选方法。

第三，CRISPR导入的选择

一旦靶位点确定，我们必须考虑如何导入。通常，CRISPR构建体可以转染到细胞进行瞬时表达，或用病毒感染。如果使用逆转录病毒或慢病毒，因为组成型Cas9表达和脱靶效应积累的潜在影响，不建议将产生的细胞用于长期研究。瞬时表达，如转染、电穿孔，或非整合型病毒（AAV或腺病毒），是建立稳定细胞系的最理想选择。同源重组的修复模板既可以是质粒，也可以是单链oligo，与Cas9和sgRNA共同转染。即使使用CRISPR技术，特定细胞中的同源重组率可能还是很低（<1-5%），因此细胞需要筛选。