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CRISPR基因编辑技术设计重要事项和关键

作者:Magigen

CRISPR技术是非常好的编辑基因工具,但是需要精心规划才能达到期望的结果。

如何更好的使用CRISPR基因编辑技术?

CRISPR设计的重要事项和关键

**,选择你希望引入的编辑类型,是小的插入缺失InDel?还是特定改变?

小的插入缺失InDel最常用于破坏基因的蛋白编码能力,在CRISPR Cas9蛋白酶切割dsDNA后,非同源末端连接NHEJ容易出错的性质往往会引入移码突变。特定改变则是插入表位或荧光标记,或引入特定突变,必须依赖同源重组(HR)通过外源性模板来修复dsDNA断裂。


如果想创建小的插入缺失,任何蛋白上都有许多可能的靶位点。在使用化脓性链球菌(S. pyogenes)的Cas9蛋白的收,潜在的靶位点是[5’-20nt-NGG]和[5’-CCN-20nt]。因为它同样高效地靶定DNA的编码或非编码链。**靶定蛋白编码区的N端,而不是C端,因为它出现在越上游,就越有可能创建出一个真正无效的等位基因。不过,在用同源重组修复时,靶位点的选择就有更多的限制;当切割位点距离修复模板的近端>30 nt时,效率急剧下降。


第二,确定靶序列,减少脱靶效应

设计sgRNA中关键的一步是避免CRISPR Cas9的脱靶效应。目前,已经有了一些控制脱靶效应的规则,并写入了的开发设计工具。利用生物信息学工具能确定表现出**的序列独特性的基因组位点。这些工具软件包括张锋实验室和Michael Boutros实验室的工具软件。

此外,如何改善着靶活性,目前还知之甚少。我们似乎不可能完全预测到最特异、最具活性的CRISPR,因此,最重要的是,根据经验检测多个不同的CRISPR,以确定着靶效果和脱靶程度。


减少CRISPR技术脱靶效应的一种方法是使用两条sgRNA以及Cas9的“切口酶”版本。这种方法有助于提高特异性,从而减少脱靶的dsDNA断裂。不过,此方法的缺点在于需要两个靶位点,这意味着一些特定位置不适合创建dsDNA断裂。当然,如果可能的话,这是基因编辑的首选方法。


第三,CRISPR导入的选择

一旦靶位点确定,我们必须考虑如何导入。通常,CRISPR构建体可以转染到细胞进行瞬时表达,或用病毒感染。如果使用逆转录病毒或慢病毒,因为组成型Cas9表达和脱靶效应积累的潜在影响,不建议将产生的细胞用于长期研究。瞬时表达,如转染、电穿孔,或非整合型病毒(AAV或腺病毒),是建立稳定细胞系的最理想选择。同源重组的修复模板既可以是质粒,也可以是单链oligo,与Cas9和sgRNA共同转染。即使使用CRISPR技术,特定细胞中的同源重组率可能还是很低(<1-5%),因此细胞需要筛选。


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