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如何正确稀释引物?

作者:Magigen

引物稀释的正确方法。

在PCR等生物实验中,如何正确的溶解和稀释引物是实验成功的**步。今天美格君就和大家一起分享一下这方面的经验。

引物一般分为干粉引物和液体引物。根据引物形态的不同,要采用不同的稀释方法。

一.干粉引物溶解稀释方法

收到引物后,在打开离心管的盖子之前,为了防开盖时引物干粉散失,在转速为3000-4000转/分钟的转速下离心约1分钟。引物保存在高浓度的状况下比较稳定。如果对实验的重复性较多,合成的OD数较大,建议分装,尽量避免反复冻融。引物一般配制成 10-100pmol/ul(umol/l)。

一般生产厂家出厂时都会注明 1 OD相当于多少umol 的量,进行稀释时的引物需要加的水量可以按以下公式计算:

要稀释成100pmol/ul ,1OD需加水量(ul)= 1 OD标示的umol数值×10000

例如:引物DNA合成报告单上标有1OD≈0.0035umol,包装量是1 OD/管。如果您希望将引物浓度定为 100umol/L,那么只需用35ul无核酸酶的双蒸水将1OD的引物干粉溶解即可。

0.0035umol x 10000 = 35ul


二.液体引物再稀释方法

液体引物再稀释可用下列公式:

引物需要稀释要达到的浓度(pmol/ul) = 母液浓度(pmol/ul) × 吸取的母液体积(ul) ÷ [ 吸取母液的体积(ul) + 加水量(ul) ]

1. Oligo DNA是以OD260单位来计算的。这是指在1ml体积、1cm 光程标准比色皿中,260nm波长下,吸光度为1A260的Oligo溶液定义为1 OD260单位。根据此定义,1 OD260 单位相当于33μg的Oligo DNA。用户可以根据此数据和Oligo DNA分子量,计算得到摩尔数,以计算不同摩尔浓度的溶液。

2.引物序列的分子量计算公式如下:

MW= (A碱基数×312) + (C碱基数×288) + (G碱基数×328) + (T碱基数×303) - 61

例如:

引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG中,碱基A、C、T、G的数量分别为:

A=1   C=3   G=11 T=6

MW=1×312+3×328+6×303-61=6541

3. Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法计算:

Oligo DNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为 324.5, 一条Oligo DNA的分子量=碱基数×324.5。

例如,一管标为5 OD260的20mer Oligo DNA

分子量=20×324.5=6490

质量数=5×33=165μg

摩尔数=165/6490=0.025μmol=25nmol

若加灭菌双蒸水 400μl溶解,则浓度为 25nmol/400μl=62.5μM

4. 装有引物的eppendorf管一般保存于-20℃,使用前稀释。

5. 由于Oligo DNA很轻, 会以干膜的形状附在管壁上,打开盖子的时极易散失。所以打开管子前请先以10,000rpm的速度,离心1分钟,然后再慢慢打开管盖。

6. 在装有引物的eppendorf管内加入100-500μl双蒸水, 然后盖好管盖,充分上下振荡5-10分钟,再次以10,000rpm离心1分钟。

7. 计算原引物管引物的浓度,必要时测OD260,核对厂家提供引物量是否正确。

8. 计算并将应用引物浓度稀释为10pmol/μl。

9. 标明原引物管、应用引物管、稀释方法, 放置在-20℃环境保存。


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