　　GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，是指在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5-10℃。不同的Tm计算公式结果会有不同。若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值**接近72℃以使复性条件**。

4、引物3'端要避开密码子的第3位。

　　如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5、引物3'端不能选择A，**选择T。

　　引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端**选择T。

6、碱基要随机分布。

　　引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发False priming。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布**是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。

　　PCR引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成Hairpin发夹结构，使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻从而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。

　　两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠，以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

　　引物二聚体及发夹结构Hairpin如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高，应小于4.5kcal/mol。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度，而使PCR 反应不能正常进行。

8、引物5'端和中间△G值应该相对较高，而3'端△G值较低。

　　△G值是指DNA 双链形成所需的自由能free energe，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5' 端和中间△G值相对较高，而3'端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3'端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构, 并引发DNA聚合反应。不同位置的△G值可以用Oligo 6等软件进行分析。

9、引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰。

　　引物的5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。3'端也不能有形成任何二级结构可能。

10、PCR扩增产物的单链不能形成二级结构。

　　某些PCR引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时**避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能△G°小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2'-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11、引物应具有特异性。

　　引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

要利用BLAST，通过比对，已经发现、并在GENEBANK中公开的物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而无法使用该引物。

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

　　各种模板的引物设计难度不一, 有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

　　做Real Time时，用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

　　（1）避免重复碱基，尤其是G。

　　（2）Tm=58-60度。

　　（3）GC=30-80%。

　　（4）3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

　　（5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

　　（6）PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80-150bp最为合适（可以延长至300 bp）。

　　（7）引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

　　而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，**是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

　　用于设计PCR引物设计的软件有很多，例如：PRIMER3、PRIMER5、PRIMER EXPRESS都是不错的选择。

　　做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于PCR引物，要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物非常不容易, 要有耐心。