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如何设计PCR引物?PCR引物设计的原则和注意事项

作者:Magigen

在PCR实验中,引物设计非常重要。

如何设计引物?今天,美格君就来谈谈引物设计的原则和注意事项。

1、**在模板cDNA的保守区间内设计PCR引物。

  DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如Mega、DNAman)进行比对Alignment,各基因相同较多的序列区间就是该基因序列的保守区。

2、引物长度**在18-22碱基之间。

   引物长度常用的是18-22bp,可以适当调整,但不应大于38bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3、引物GC含量在40%~60%之间,Tm值**接近72℃。

  GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度,是指在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5-10℃。不同的Tm计算公式结果会有不同。若按公式Tm=4(G+C+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55-80℃,其Tm值**接近72℃以使复性条件**。

4、引物3'端要避开密码子的第3位。

  如扩增编码区域,引物3'端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。

5、引物3'端不能选择A,**选择T。

  引物3'端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G、C错配的引发效率介于A、T之间,所以3'端**选择T。

6、碱基要随机分布。

  引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发False priming。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布**是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。

  PCR引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成Hairpin发夹结构,使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻从而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。

  两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3'端的互补重叠,以防止引物二聚体(Dimer与Cross dimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

  引物二聚体及发夹结构Hairpin如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高,应小于4.5kcal/mol。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度,而使PCR 反应不能正常进行。

8、引物5'端和中间△G值应该相对较高,而3'端△G值较低。

  △G值是指DNA 双链形成所需的自由能free energe,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定。应当选用5' 端和中间△G值相对较高,而3'端△G值较低(绝对值不超过9)的引物。引物3'端的△G 值过高,容易在错配位点形成双链结构, 并引发DNA聚合反应。不同位置的△G值可以用Oligo 6等软件进行分析。

9、引物的5'端可以修饰,而3'端不可修饰。

  引物的5' 端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。

引物的延伸是从3'端开始的,不能进行任何修饰。3'端也不能有形成任何二级结构可能。

10、PCR扩增产物的单链不能形成二级结构。

  某些PCR引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时**避开二级结构区域。用有关软件(比如RNAstructure)可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能△G°小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2'-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11、引物应具有特异性。

  引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。

      要利用BLAST,通过比对,已经发现、并在GENEBANK中公开的物种基因序列当中,除了和你的目标基因之外,还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列,如和你的目标序列之外的序列相同的序列,则可能扩出其他序列的产物,那么这个引物的特异性就很差,从而无法使用该引物。

      要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

  各种模板的引物设计难度不一, 有的模板本身条件比较困难,例如GC含量偏高或偏低,导致找不到各种指标都十分合适的引物;用作克隆目的的PCR,因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。


  做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求:

  (1)避免重复碱基,尤其是G。

  (2)Tm=58-60度。

  (3)GC=30-80%。

  (4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

  (5)正向引物与探针离得越近越好,但不能重叠。

  (6)PCR扩增产物长度: 引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可;80-150bp最为合适(可以延长至300 bp)。

  (7)引物的退火温度要高,一般要在60度以上;


  而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力,即引物应该跨外显子,**是引物能跨外显子的接头区,这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

  用于设计PCR引物设计的软件有很多,例如:PRIMER3、PRIMER5、PRIMER EXPRESS都是不错的选择。

  做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于PCR引物,要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物非常不容易, 要有耐心。

  

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