利用CRISPR Cas12a蛋白和微流控空间编码技术实现多重核酸检测

作者：Zhichen Xu

2022年10月29日，中国科学院精密测量院杨运煌团队在国际期刊<自然>发表了题为“Microfluidic space coding for multiplexed nucleic acid detection via CRISPR-Cas12a and recombinase polymerase amplification”的研究论文。

论文简介

快速、廉价和可以进行多重检测的核酸检测技术对人类健康非常重要，但开发这种技术这仍然是一个重大挑战。在此，我们提出了一个新的核酸检测平台，名为MiCaR，它将微流体装置与CRISPR-Cas12a耦合，并进行多重重组酶聚合酶扩增。只有一个荧光探针，MiCaR可以通过微流控空间编码，同时测试多达30个核酸靶点。检测限达到0.26阿摩尔，多重分析仅需40 分钟。我们通过有效检测9价HPV疫苗靶向的9种HPV亚型，证明了MiCaR的效用，在对100例HPV感染风险患者样本的检测中显示出97.8%的敏感性和98.1%的特异性。此外，我们还通过成功测试八种最具临床意义的呼吸道病毒，展示了我们方法的可推广性。我们预计这种有效、未经修饰和通用的平台将广泛用于多重核酸检测。

我们设计的核酸检测平台MiCaR比较独特，该平台将微流控设备与CRISPR Cas12a和多重恒温扩增RPA整合在一起，以解决与多重核酸检测NAT相关的所有挑战，我们的方法是利用微流控设备的独特特性，实现精确的流体控制和空间试剂布置。MiCaR不是使用多个荧光团或颜色编码来指示不同的目标，而是基于空间位置或仅使用单个荧光团的空间编码来区分目标信号。通过将各种crRNA预加载到30个指定的孔中，在样品被移液到星爆形状微芯片（SS芯片）的中心后，系统同时启动多达30个基于CRISPR的裂解分析。

在本研究中，我们评估了SS芯片的性能，以确保均匀的液体分配和混合。我们选择了9价HPV疫苗（9vHPV）靶向的9种HPV亚型。随后，我们仔细优化并证明了多重恒温扩增RPA测定的效率和特异性。此外，我们进行了一项包含9 × 9个针对HPV亚型的crRNA，以确定**的crRNA组合。此外，大量的测试表明，分别针对未放大和放大的目标， MiCaR检测灵敏度可以分别达到0.1 nM和0.26 aM。此外，我们将MiCaR应用于检测HPV感染风险患者的样本。我们总共测试了100个样品，并进行了3000次分析。MiCaR显示出极大的稳定性，芯片上HPV分型结果与临床结果高度一致，敏感性为97.8%，特异性为98.1%。最后，我们应用MiCaR成功测试了八种常见的呼吸道病毒，以确认我们方法的通用性。因此，研究结果表明，MiCaR允许快速、低成本和高灵敏度、特异性和可靠性的多路核酸检测。该方法可广泛应用于特定感染的诊断，有利于提高临床检测的准确性和效率。

MiCaR多路复用核酸检测系统

图1. MiCaR多路复用核酸检测系统

MiCaR平台原理

MiCaR多路复用核酸检测系统在HPV分型中的应用。

取样后，加热宫颈细胞以诱导HPV DNA的释放。然后，在不提取DNA的情况下，直接进行多重恒温扩增（图1a）。将扩增的产物加载到微流控装置上，并使用基于CRISPR的裂解试验进行测试。通过自动荧光成像系统获得读数。如图1b所示，MiCaR的检测依赖于星爆形状芯片（SS芯片），该芯片被设计为中枢和辐条网络。将样品加载到中心的孔中，辐条微通道将样品均匀分布到30个标记孔中，这些标记孔预先加载有含有Cas12a、crRNA和荧光报告物的特定Cas12a检测混合物。使用的报告物是一种荧光团猝灭剂（FQ）标记的寡核苷酸，名为TBA11（GGTTGGTTGG），是凝血酶结合适体（TBA）的截短形式，已证明正常ssDNA报告子具有更高的灵敏度。然而，当HPV DNA和crRNA之间存在失配时，会检测到低的背景信号。在装置上测试空白对照（在不存在crRNA的情况下使用报告子和Cas12a）以获得基本背景。这种基于空间编码的策略通过采用“一起放大，单独检测”原理，能够有效识别多个目标。仅使用一个荧光探针简化了系统设置和数据分析，并且（针对同一目标的）三份芯片上测试也确保了检测的准确性和可靠性。

用于HPV组合的引物和crRNA设计

HPV亚型多余100种，包括高危型和低危型，可分别导致宫颈癌和尖锐湿疣。由于不同HPV亚类型的相关风险不同，因此有必要筛查和识别感染，并预防后续并发症，如宫颈癌。疫苗可以预防某些HPV感染引起的癌症和疾病。目前，9价（HPV−6.−11, −16, −18, −31, −33, −45, −52, −58）HPV疫苗被认为是预防HPV感染最有效的疫苗。在本研究中，我们选择了9vHPV靶向的9种HPV亚型，以开发基于MiCaR的检测系统。我们首先为9个靶点设计了相关的恒温扩增RPA引物。RPA是一种高度灵敏的等温扩增方法，需要最少的样品制备（图2a，左）。由于HPV亚型由L1基因序列决定，我们设计了一系列针对9个靶点中该区域的引物（图2a，右）。

图2. 用于HPV组合的引物和crRNA设计

这九种HPV亚型的L1基因序列显示出高度相似性。为了选择合适的引物，进行了两轮设计和测试。

在**轮中，设计了10对引物。使用琼脂糖凝胶电泳测定这些引物的性能。大多数引物工作良好，显示出清晰而密集的条带。然而，HPV-6和HPV-45的引物没有产生明显的条带。因此，根据引物设计的一般原则，为这两种亚型设计了另外三对引物。据观察，引物HPV-6a、-6b、-45a、-45b和-45c成功扩增了相关靶点。

本研究使用的材料

RPA TwistAmp Basic试剂盒购自TwistDx（英国剑桥），Magigen CRISPR Cas12蛋白（ND2006 Magigen LbCas12a）购自Magigen公司（中国广州）。HPV L1基因、八种呼吸道病毒的相关基因序列和TBA11-FQ的质粒从中国北京青科公司获得。所用引物和crRNA由Sangon Biotech公司（中国上海）合成。DNA琼脂糖和核酸凝胶染色剂购自Yeasen公司（中国上海）。荧光素和磺基霍达明B购自上海阿拉丁生化技术有限公司（中国上海）。蒸汽眼罩购自Kao Commercial（中国上海）。

更详细的资料请参考我们的论文：Microfluidic space coding for multiplexed nucleic acid detection via CRISPR-Cas12a and recombinase polymerase amplification。

该论文发布在国际期刊<自然杂志>，欢迎大家搜索。