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利用CRISPR Cas12a蛋白和微流控空间编码技术实现多重核酸检测

作者:Zhichen Xu

2022年10月29日,中国科学院精密测量院杨运煌团队在国际期刊<自然>发表了题为“Microfluidic space coding for multiplexed nucleic acid detection via CRISPR-Cas12a and recombinase polymerase amplification”的研究论文。


论文简介

快速、廉价和可以进行多重检测的核酸检测技术对人类健康非常重要,但开发这种技术这仍然是一个重大挑战。在此,我们提出了一个新的核酸检测平台,名为MiCaR,它将微流体装置与CRISPR-Cas12a耦合,并进行多重重组酶聚合酶扩增。只有一个荧光探针,MiCaR可以通过微流控空间编码,同时测试多达30个核酸靶点。检测限达到0.26阿摩尔,多重分析仅需40 分钟。我们通过有效检测9价HPV疫苗靶向的9种HPV亚型,证明了MiCaR的效用,在对100例HPV感染风险患者样本的检测中显示出97.8%的敏感性和98.1%的特异性。此外,我们还通过成功测试八种最具临床意义的呼吸道病毒,展示了我们方法的可推广性。我们预计这种有效、未经修饰和通用的平台将广泛用于多重核酸检测。


我们设计的核酸检测平台MiCaR比较独特,该平台将微流控设备与CRISPR Cas12a和多重恒温扩增RPA整合在一起,以解决与多重核酸检测NAT相关的所有挑战,我们的方法是利用微流控设备的独特特性,实现精确的流体控制和空间试剂布置。MiCaR不是使用多个荧光团或颜色编码来指示不同的目标,而是基于空间位置或仅使用单个荧光团的空间编码来区分目标信号。通过将各种crRNA预加载到30个指定的孔中,在样品被移液到星爆形状微芯片(SS芯片)的中心后,系统同时启动多达30个基于CRISPR的裂解分析。

在本研究中,我们评估了SS芯片的性能,以确保均匀的液体分配和混合。我们选择了9价HPV疫苗(9vHPV)靶向的9种HPV亚型。随后,我们仔细优化并证明了多重恒温扩增RPA测定的效率和特异性。此外,我们进行了一项包含9 × 9个针对HPV亚型的crRNA,以确定**的crRNA组合。此外,大量的测试表明,分别针对未放大和放大的目标, MiCaR检测灵敏度可以分别达到0.1 nM和0.26 aM。此外,我们将MiCaR应用于检测HPV感染风险患者的样本。我们总共测试了100个样品,并进行了3000次分析。MiCaR显示出极大的稳定性,芯片上HPV分型结果与临床结果高度一致,敏感性为97.8%,特异性为98.1%。最后,我们应用MiCaR成功测试了八种常见的呼吸道病毒,以确认我们方法的通用性。因此,研究结果表明,MiCaR允许快速、低成本和高灵敏度、特异性和可靠性的多路核酸检测。该方法可广泛应用于特定感染的**,有利于提高临床检测的准确性和效率。

MiCaR多路复用核酸检测系统

图1. MiCaR多路复用核酸检测系统


MiCaR平台原理

MiCaR多路复用核酸检测系统在HPV分型中的应用。

取样后,加热宫颈细胞以诱导HPV DNA的释放。然后,在不提取DNA的情况下,直接进行多重恒温扩增(图1a)。将扩增的产物加载到微流控装置上,并使用基于CRISPR的裂解试验进行测试。通过自动荧光成像系统获得读数。如图1b所示,MiCaR的检测依赖于星爆形状芯片(SS芯片),该芯片被设计为中枢和辐条网络。将样品加载到中心的孔中,辐条微通道将样品均匀分布到30个标记孔中,这些标记孔预先加载有含有Cas12a、crRNA和荧光报告物的特定Cas12a检测混合物。使用的报告物是一种荧光团猝灭剂(FQ)标记的寡核苷酸,名为TBA11(GGTTGGTTGG),是凝血酶结合适体(TBA)的截短形式,已证明正常ssDNA报告子具有更高的灵敏度。然而,当HPV DNA和crRNA之间存在失配时,会检测到低的背景信号。在装置上测试空白对照(在不存在crRNA的情况下使用报告子和Cas12a)以获得基本背景。这种基于空间编码的策略通过采用“一起放大,单独检测”原理,能够有效识别多个目标。仅使用一个荧光探针简化了系统设置和数据分析,并且(针对同一目标的)三份芯片上测试也确保了检测的准确性和可靠性。


用于HPV组合的引物和crRNA设计

HPV亚型多余100种,包括高危型和低危型,可分别导致宫颈癌和尖锐湿疣。由于不同HPV亚类型的相关风险不同,因此有必要筛查和识别感染,并预防后续并发症,如宫颈癌。疫苗可以预防某些HPV感染引起的癌症和疾病。目前,9价(HPV−6.−11, −16, −18, −31, −33, −45, −52, −58)HPV疫苗被认为是预防HPV感染最有效的疫苗。在本研究中,我们选择了9vHPV靶向的9种HPV亚型,以开发基于MiCaR的检测系统。我们首先为9个靶点设计了相关的恒温扩增RPA引物。RPA是一种高度灵敏的等温扩增方法,需要最少的样品制备(图2a,左)。由于HPV亚型由L1基因序列决定,我们设计了一系列针对9个靶点中该区域的引物(图2a,右)。

图2. 用于HPV组合的引物和crRNA设计


这九种HPV亚型的L1基因序列显示出高度相似性。为了选择合适的引物,进行了两轮设计和测试。

在**轮中,设计了10对引物。使用琼脂糖凝胶电泳测定这些引物的性能。大多数引物工作良好,显示出清晰而密集的条带。然而,HPV-6和HPV-45的引物没有产生明显的条带。因此,根据引物设计的一般原则,为这两种亚型设计了另外三对引物。据观察,引物HPV-6a、-6b、-45a、-45b和-45c成功扩增了相关靶点。


本研究使用的材料

RPA TwistAmp Basic***购自TwistDx(英国剑桥),Magigen CRISPR Cas12蛋白(ND2006 Magigen LbCas12a)购自Magigen公司(中国广州)。HPV L1基因、八种呼吸道病毒的相关基因序列和TBA11-FQ的质粒从中国北京青科公司获得。所用引物和crRNA由Sangon Biotech公司(中国上海)合成。DNA琼脂糖和核酸凝胶染色剂购自Yeasen公司(中国上海)。荧光素和磺基霍达明B购自上海阿拉丁生化技术有限公司(中国上海)。蒸汽眼罩购自Kao Commercial(中国上海)。



更详细的资料请参考我们的论文:Microfluidic space coding for multiplexed nucleic acid detection via CRISPR-Cas12a and recombinase polymerase amplification。

该论文发布在国际期刊<自然杂志>,欢迎大家搜索。


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