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LAMP引物设计原则和LAMP引物设计的要点

作者:LAMP技术

环介导等温扩增技术LAMP, 英文是Lloop-mediated isothermal amplification,是一种核酸扩增技术,被广泛地应用于病原微生物检测和传染性疾病**等领域,具有快速、准确的特点。


LAMP扩增反应使用4-6个引物来识别目标DNA中的几个特定的区域。LAMP扩增技术的原理是:DNA在65℃左右可以处于动态平衡状态,在此温度下,利用4条特异性引物,依靠一种链置换DNA聚合酶,使链置换DNA的合成不停地自我循环复制,实现大量扩增。


LAMP扩增引物的种类

LAMP扩增技术使用的引物主要有一下几种:

FIP引物 :上游内部引物,由F2区和F1C区域组成,F2区与靶基因3’端的F2c区域互补,F1C区与靶基因5' 端的F1区域序列相同。

F3引物:上游外部引物,由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。

BIP引物:下游内部引物,由B1C和B2区域组成,B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补,B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.

B3引物:下游外部引物,由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。

Loop F/B:环状引物,可选,可提高反应速度(在10-15mins内完成检测),并提高检出效率(高出7个数量级),灵敏度要求不高的反应可以不用Loop F/B。


LAMP引物设计软件

一般LAMP引物是使用设计LAMP引物的专用软件,例如PrimerExplore等,在设计中应特别注意Tm 值、GC含量、碱基组成和二级结构等问题。


LAMP引物的结构和分布

图1. LAMP引物的结构和分布


LAMP引物设计原则

LAMP引物设计的要点:


1. 引物的Tm值

在富含 GC 和 正常的情况下约为 60-65°C,对于富含 AT 的约为 55-60°C,具体来说各引物如下:

F1c/B1c=64~65℃

F2/B2=59~61℃

F3/B3=59~61℃

LoopF/LoopB=64~65℃


2. 引物的GC含量

GC丰富和正常的情况下,GC含量约为 50-60%;AT丰富的情况下,GC含量约为 40-50%。


3. 引物区域之间的距离

F2的5'端与B2的5'端距离为120-160bp

F2的5’末端到F1c的5’末端约为40~60bp

F3的3’末端到F2的5’末端约为0~60bp

LoopF 位于F2c的3’末端和F1c的5’末端之间

LoopB 位于B1的3’末端和B2的5’末端之间


4. 避免二级结构

引物的设计应使其不易形成二级结构。3' 端序列不应富含 AT 或与其他引物互补。


5. 引物末端的稳定性

从以下末端区域计算 6bp 的 dG 应小于 -4kcal/mol,F1c/B1c 的 5' 末端和 F2/B2 的 3' 末端以及 F3/B3。


6.其他

如果目标序列上存在限制性酶切位点,除引物区域外,可用于确认扩增产物。


LAMP扩增反应最常见问题及解决办法

LAMP反应相对于qPCR来说更容易出现假阳性。其中,引物二聚体是产生假阳性的主要原因之一。

另外一个导致LAMP反应假阳性的原因是气溶胶污染,通过更换新的试剂、彻底清洁仪器和设备有助于避免污染。

在排除了气溶胶污染因素之外,如果通过优化Mg离子浓度依然对解决假阳性没有帮助的话,这种情况下通常建议需要重新设计引物。

引物的设计对LAMP扩增反应质量影响很大。要熟悉LAMP引物设计的原值,熟记LAMP引物设计的要点。建议在不同的反应温度下多测试几套引物,选择结果**的一套作为**引物。


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