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什么是引物二聚体?引物二聚体形成的原因?

作者:引物二聚体

什么是引物二聚体?

引物二聚体,英文是primer dimer,是在PCR反应中, 两条引物上的互补碱基相结合形成的聚合体,


引物二聚体形成的原因:


常见的引物二聚体形成的原因主要有:

引物二聚体形成的原因

1. PCR循环次数过高

2. PCR退火温度低

3. 模板量过低

4. 引物浓度过大

5. 引物长度过短


引物二聚体的形成是在实时荧光定量PCR设计和验证过程中最常见的问题之一。而最根本的原因是由引物之间或者引物自身 3'端部分碱基互补结合造成的。当引物对之间的部分序列存在同源性时,可形成引物二聚体。如果在 PCR 反应过程中引物退火形成二聚体,则 TaqDNA 聚合酶可延伸二聚体,形成长于原始引物的产物,它可导致循环过程中更易出现退火错误。根据长度的不同,引物也可能出现自身折叠,由此与模板形成冲突。反应的复杂性 (尤其在多重反应过程中) 可使上述不良影响发生的几率增加。


如何确定是否存在引物二聚体?

引物二聚体是引物的3'端间相互错配扩增形成的产物。引物二聚体的出现是不可避免的,只是或多或少的问题,即使是电泳时看不到引物二聚体,也不代表没有二聚体的出现,只是含量比较低,实验人员的肉眼无法看到而已。

图1. 引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带


凝胶电泳是显示引物二聚体的一种**的方法。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带(图1),通常位100 bp 以下。在 PCR 过程中,二聚体的形成与模板的退火及延伸之间存在竞争作用。引物二聚体通常随模板的减少而增加。单独采用凝胶电泳分析进行验证的缺点在于,其灵敏度最低仅达到纳克级,因此可能无法得出结果。

熔解曲线图2. 熔解曲线


凝胶电泳分析的优势是当熔解曲线的数据同时可用时,产物的大小有助于对结果进行综合解释。熔解曲线,也称解离曲线,是利用双链 DNA 结合染料获得的标准反应热廊线。如果扩增具有极好的特异性,则实时荧光定量 PCR 板上每个反应孔的解离曲线将出现一个较窄的单峰。引物二聚体的荧光强度较低,呈较宽的“波形”,显示其在 70°C 左右熔解。出现此峰形和熔解温度主要是由于引物二聚体的长度较小且不确定。若对解离曲线中是否存在引物二聚体有任何疑问,可将观察的结果与无模板对照NTC(No Template Control,是阴性对照)反应孔相比较,当模板不存在时,更易出现引物二聚体峰 (图2),熔解曲线中突出显示了特异性扩增 (图2a) 和引物二聚体效应(图2b)。可利用 NTC 样本在熔解曲线中产生多余的峰(图2b) 识别出引物二聚体。


引物二聚体对PCR反应有什么影响?

这种聚合体出现了,就相当于原本可以扩增的原料链减少了,即会导致扩增的效率降低,所以**能避免这种物质的出现.


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