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PCR引物二聚体的影响?如何消除引物二聚体?

作者:PCR入门

引物二聚体的形成是PCR最常见的问题之一。当引物对之间的一些序列具有同源性时,可以形成引物二聚体。


形成引物二聚体的影响

如果引物在PCR反应过程中退火形成二聚体,Taq DNA聚合酶可以延伸二聚体以形成比原始引物更长的产物,这可以导致循环中的退火错误。

引物二聚体对反应的影响很大程度上取决于反应中使用的化学物质。基于荧光探针的反应受引物二聚体的影响不大,这是因为引物二聚体区域很少出现探针退火断裂的现象。这时候引物的竞争是要考虑的主要问题。基于双链DNA的染料结合反应受引物二聚体的影响很大。因为染料的结合模式是非特异性的,所以在反应过程中监控的荧光信号可以被增强。这会相应地改变Ct值,并使结果出现偏差。


如何消除引物二聚体?

**在引物设计阶段就采取简单的预防措施,从一开始就避免二聚体的形成。如果出现引物二聚体,有很多方法可以减少或消除PCR反应中的引物二聚体。



消除或减少PCR产物中引物二聚体的方法

1. 最根本的解决方法就是重新设计引物。从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法。

2. 检查Taq酶,引物,Mg2+的浓度,如果浓度过高,可降低它们的浓度。

3. 检查模板。可能模板有问题,模板浓度过小,适当加大模板量。

4. 将上下引物混合后,在100℃的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出,放于冰块之上瞬时冷却,然后再加入反应体系当中,这样引物二聚体就会消失。原理:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100℃的沸水中煮5分钟,可使引物变为单链,以减少二聚体。不过有人认为在PCR仪上95度变性5min也同样达到目的,而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。

5. 所配制的MIX中加5%的甘油、或者5%的DMSO, 可以增强特异性。

6. PCR反应体系的配制在冰上进行,最后加Taq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。

7. 优化热循环条件,主要是提高退火温度。在大多数情况下,两步循环(从95℃变性步骤到60℃退火和延伸步骤)有利于强扩增,因此引物设计中设定的成功退火温度为60℃。

8. 降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加Mg2+浓度,这要根据扩增片断长度而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些。

9.若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别,则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。

10.以上次的PCR产物作模板,进行二次PCR, 可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,如果间隔较长可以稀释50-100倍。

11. 可以降低引物浓度,甚至不同比例的正向引物和反向引物都有帮助。大多数情况下,每种引物的理想终浓度为200~600 nM,但必要时可降至60 nM。

12. 镁的更佳浓度一般为3mM左右,高于此浓度,容易形成引物二聚体。


13. 如果引物形成二聚体的倾向没有被评估,如果必要的话, 它应该被补充和重新设计。通常,更好的设计是使用热启动DNA聚合酶,并在冰上反应。

14. 理论上,对于相同的靶标,应该同时检测多个引物组。这可以节省很多时间,因为如果这些引物中的一个可以立即起作用,那么在优化过程中花费的时间就可以减少。

15. 增加循环数。


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