PCR引物二聚体的影响？如何消除引物二聚体？

作者：PCR入门

引物二聚体的形成是PCR最常见的问题之一。当引物对之间的一些序列具有同源性时，可以形成引物二聚体。

形成引物二聚体的影响

如果引物在PCR反应过程中退火形成二聚体，Taq DNA聚合酶可以延伸二聚体以形成比原始引物更长的产物，这可以导致循环中的退火错误。

引物二聚体对反应的影响很大程度上取决于反应中使用的化学物质。基于荧光探针的反应受引物二聚体的影响不大，这是因为引物二聚体区域很少出现探针退火断裂的现象。这时候引物的竞争是要考虑的主要问题。基于双链DNA的染料结合反应受引物二聚体的影响很大。因为染料的结合模式是非特异性的，所以在反应过程中监控的荧光信号可以被增强。这会相应地改变Ct值，并使结果出现偏差。

如何消除引物二聚体？

**在引物设计阶段就采取简单的预防措施，从一开始就避免二聚体的形成。如果出现引物二聚体，有很多方法可以减少或消除PCR反应中的引物二聚体。

消除或减少PCR产物中引物二聚体的方法

1. 最根本的解决方法就是重新设计引物。从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法。

2. 检查Taq酶，引物，Mg2+的浓度，如果浓度过高，可降低它们的浓度。

3. 检查模板。可能模板有问题，模板浓度过小，适当加大模板量。

4. 将上下引物混合后，在100℃的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出，放于冰块之上瞬时冷却，然后再加入反应体系当中，这样引物二聚体就会消失。原理：引物可能会发生发夹结构，自身环化等结构，在100℃的沸水中煮5分钟，可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。

5. 所配制的MIX中加5%的甘油、或者5%的DMSO, 可以增强特异性。

6. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加Taq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。

7. 优化热循环条件，主要是提高退火温度。在大多数情况下，两步循环(从95℃变性步骤到60℃退火和延伸步骤)有利于强扩增，因此引物设计中设定的成功退火温度为60℃。

8. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加Mg2+浓度，这要根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些。

9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。

10.以上次的PCR产物作模板，进行二次PCR, 可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100-1000倍，如果间隔较长可以稀释50-100倍。

11. 可以降低引物浓度，甚至不同比例的正向引物和反向引物都有帮助。大多数情况下，每种引物的理想终浓度为200~600 nM，但必要时可降至60 nM。

12. 镁的更佳浓度一般为3mM左右，高于此浓度，容易形成引物二聚体。

13. 如果引物形成二聚体的倾向没有被评估，如果必要的话, 它应该被补充和重新设计。通常，更好的设计是使用热启动DNA聚合酶，并在冰上反应。

14. 理论上，对于相同的靶标，应该同时检测多个引物组。这可以节省很多时间，因为如果这些引物中的一个可以立即起作用，那么在优化过程中花费的时间就可以减少。

15. 增加循环数。