基于微流控空间编码和CRISPR-Dx的多靶标核酸检测技术

基于以上挑战，中国科学院精密测量院杨运煌团队展开研究，于2022年10月29日，在Nature Communications上发表了题为“Microfluidic space coding for multiplexed nucleic acid detection via CRISPR-Cas12a and recombinase polymerase amplification”的文章，提出一种名为“MiCaR”的高性能多靶标检测平台。

“MiCaR”多靶标核酸检测技术基于微流控空间编码和CRISPR-Dx技术，可在40分钟内检测30种不同的病原体，灵敏度达到了0.26 aM。

“MiCaR”检测平台特点可总结为

1. 有效且正确扩增多个(如≥4个)核酸靶点

2. 在合适的温度下扩增和识别靶标

3. 精确识别靶标，不受任何干扰

4. 准确区分信号并将其与对应靶标进行关联

研究人员通过有效地检测9价HPV疫苗对应的9种HPV亚型，证明了MiCaR的实用性，以及其在感染性疾病诊断和流行病学监测方面的潜力和应用价值。

以HPV亚型检测为例，演示“MiCaR”平台的使用流程。首先进行取样，加热样本释放核酸，将释放的核酸直接进行重组酶聚合酶扩增（RPA），最后将扩增产物和CRISPR检测液加入到放射状芯片（SS-Chip）中，加热后读取结果。

其中SS-Chip由30个孔位轮状辐射分布并与中央孔位相连，CRISPR检测液提前加入30个孔位，样本从中央孔位加载，每个孔位都能独立进行CRISPR检测。

为验证“MiCaR”平台对九价疫苗里9种HPV病毒亚型检测能力，该研究将含有9种HPV亚型各自特定片段的质粒和9种crRNA进行交叉反应，结果显示其检测特异性高（如下图所示）；制备9种不同浓度的HPV亚型靶标质粒（10^-12、10^-13、10^-14、10^-15、10^-16、10^-17、10^-18、0 M）验证其灵敏度，结果显示对所有靶标检测限达10^-17至10^-18M。

图解：9种HPV质粒和9种crRNA交叉实验

图解：HPV临床检测（红色）和MiCaR检测（绿色）结果比对

研究基于“MiCaR”的方法检测8种最具临床相关性的呼吸道病毒，包括B型流感病毒（FLUBV）、人冠状病毒NL63（HCoV-NL63）、人冠状病毒OC43（HCoV-OC43）、人呼吸道合胞病毒（HRSV）、人冠状病毒HKU1（HCoV-HKU1）、SARS-CoV-2、人副流感病毒3型（HPIV-3）和人偏肺病毒（HMPV），通过对8种RVP靶标质粒与8种crRNA进行交叉反应实验，和对8种RVP靶标混合质粒与8种crRNA分别进行CRISPR检测，结果均表明“MiCaR”对RVP靶标检测强特异性，进一步证明“MiCaR”方法可以作为一种多病原体核酸检测的通用平台。

图解：8种RVP靶标检测特异性结果

该研究团队表示，“MiCaR”充分展现了多重RPA的扩增、CRISPR Cas12a系统在靶标识别方面的高特异性，以及微流控设备在液体处理方面的显著作用。本研究虽然只通过9种HPV亚型和8种呼吸道病毒验证“MiCaR”检测平台的通用性，但其（30 plex SS-Chip）单次检测靶标数量可达30个。团队将继续优化MiCaR扩增和检测条件及微流控装置，以实现一管法和自动化操作。

本文章CRISPR Cas12a蛋白由美格生物提供，产品性能已被多个高水平研发团队采用与验证，活性领先国际顶尖品牌，实现国产替代。美格生物将继续为科研赋能，助力分子检测领域研究。

作者介绍：

徐志辰，2020年本科毕业于华中科技大学同济医学院，随后在中国科学院精密测量院硕博连读，主要从事微流控和CRISPR检测技术。

通讯作者介绍：

李颖研究员，博士，博导；从事微流控生物芯片研究近十年，专注于转化医学和精准医疗等相关研究，在JACS, ACS Nano, Science Advances, Analytical Chemistry, Biosensors and Bioelectronics等期刊上已发表SCI论文30余篇；其中**作者/通讯作者论文17篇，授权中国发明专利8项，美国专利2项，另有3项中国专利（为**发明人）和1项美国专利正在申请中，出版书籍章节一节；现为《Military Medical Research》青年编委。

团队介绍：

核酸复合物结构与功能研究组，研究PI:杨运煌研究员，课题组主要从事NMR、蛋白质组学和分子检测领域研究，拥有两名研究员和两名副研究员。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-022-34086-y

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