北京大学汪阳明团队开发新型线粒体碱基编辑器

作者：生物世界

近日，北京大学未来技术学院汪阳明实验室在 Nature Communications 期刊发表了题为：DddA homolog search and engineering expand mitochondrial base editing 的研究论文。

该研究鉴定了多个来源于微生物中的双链DNA脱氨酶（DddA），并将其中一种改造成为线粒体碱基编辑器。

线粒体（mitochondrion），是细胞的“能量工厂”，线粒体内有一套独立于细胞核的遗传物质——线粒体DNA（mtDNA），人类mtDNA的长度为16569bp，拥有37个基因，编码13种蛋白，这些蛋白都参与细胞的能量代谢。

由于线粒体在能量稳态中的重要作用，mtDNA中的单碱基突变就可导致发育障碍、神经肌肉疾病、癌症进展等等多种人类疾病。因此，开发针对mtDNA的基因编辑工具一直是线粒体遗传学领域的长期目标。在mtDNA中精确诱导碱基突变，有助于解释这些突变在发病机制中的作用，也可作为相应的治疗方法。

**代基因编辑技术ZFN和第二代基因编技术TALEN，可以靶向含有特定基因突变的mtDNA，从而消除突变的mtDNA。但这两种方法都只能消除mtDNA，而不能引入特定的序列变化。

第三代基因编辑技术CRISPR，包括Cas9、Base Editor、Prime Editor，需要gRNA引导Cas蛋白与目标DNA结合，但目前并无有效方法将外源RNA高效导入线粒体内，这导致基于CRISPR的基因编辑工具无法应用于线粒体基因编辑。

2018年，Joseph Mougous 教授实验室的博士后 Marco de Moraes 在伯克霍尔德菌中无意间发现了一种细菌毒素——DddA，DddA可以在DNA双链上催化胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），这是前所未见的。

此后，Joseph Mougous 教授与刘如谦团队合作，于2020年7月8日，在 Nature 期刊发表了题为：A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing 的研究论文。

该研究开发了一种不依赖CRISPR的碱基编辑器——DdCBE，能够实现对线粒体基因组（mtDNA）的精准编辑，为研究线粒体遗传病和治疗线粒体遗传病带来了前所未有的工具。该研究也被认为是“问鼎线粒体研究领域的圣杯”。

该研究基于DddA，它可以催化双链DNA（dsDNA）中胞苷的脱氨，将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。将DddA分裂半体与转录激活子样效应子阵列蛋白（TALE）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂融合，产生无RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器——DdCBE，可催化人mtDNA中C•G到T•A的转化。

2022年4月4日，刘如谦团队在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA 的研究论文。

刘如谦团队对线粒体碱基编辑器DdCBE进行了重要升级，通过噬菌体辅助连续进化（PACE）和噬菌体辅助非连续进化（PANCE）技术对DdCBE进行定向改造，开发出了两个升级版DdCBE，这两个升级版DdCBE不仅具有更高的编辑效率，还具有更广泛的序列编辑范围，除了编辑线粒体基因，还能编辑细胞核DNA。

这项研究为在人类线粒体中进行高效基因编辑提供了新工具，也大大提高了对全蛋白碱基编辑的有效性和适用性。

然而，刘如谦团队开发的这类线粒体碱基编辑器的序列兼容性较低，例如DdCBE只对T之后的C有较高的编辑效率，编辑后将C突变为U，该碱基将被识别为T。而他开发的升级版DdCBE能够编辑A，T和C之后的C，但能够编辑G之后C的线粒体碱基编辑器仍然缺乏。

在这篇发表于 Nature Communications 期刊的论文中，汪阳明实验室鉴定了多个来源于微生物中的双链DNA脱氨酶（DddA），并将其中一种改造成为线粒体碱基编辑器。

线粒体碱基编辑器成功编辑

图1.思邈菌DddA衍生的线粒体碱基编辑器成功编辑多个线粒体基因组位点

汪阳明实验室米黎同学在研究伯克霍尔德菌DddA的序列和结构时，发现其羧基端存在一段序列，这些序列对于DddA的脱氨活性十分重要（图2a）。利用这一重要信息，结合PSI-BLAST生物信息学分析手段，研究团队在现有微生物的基因组序列中鉴定了多个与DddA同源的双链脱氨酶。进一步的细致分析发现，来源于思邈菌（Simiaoa Sunni；以中国唐代“药王”孙思邈命名）的DddA同源基因（Ddd_Ss），具有能够编辑A，T和G之后C的活性（图2b），从而有可能弥补目前线粒体碱基编辑器的缺口。

研究团队进一步利用Ddd_Ss构造的线粒体碱基编辑器，成功在多种细胞中实现了对14个线粒体基因组特定位点的编辑。通过引入 David Liu 等人之前发现的提高脱氨酶活性的突变，研究团队成功构建了模拟Leber遗传性视神经病变中的线粒体基因突变，发现这些突变会导致线粒体功能的减弱（图2c、d）。

DddA羧基端序列

图2. DddA羧基端序列的重要性

（a），三种不同来源的DddA的序列偏好(b)，及经Dd_Ss衍生的线粒体碱基编辑器编辑后的细胞线粒体功能分析（c、d）。

有意思的是，反过来将Ddd_Ss中一个位点（N1370）引入到伯克霍尔德菌的DddA（Ddd_Bc）时，成功提高了Ddd_Bc衍生的线粒体碱基编辑器的活性和序列兼容性。这些研究拓展了线粒体碱基编辑器的序列兼容性，并为未来开发新的线粒体碱基编辑器提供资源和参考。

线粒体作为细胞的“能量工厂”，线粒体基因组（mtDNA）与人类的衰老、癌症，以及其他多种疾病有着密切关系，线粒体碱基编辑器的发明和改进，也为相关研究和疾病治疗带来了全新工具。

该研究拓展了线粒体碱基编辑器的序列兼容性，但并没有解决该领域目前广泛存在的脱靶问题，未来需要更多更精巧的设计来实现高效和高特异性的编辑；在此之前，线粒体碱基编辑器的应用仍然会面临挑战。

北京大学未来技术学院博士生米黎和北大-清华生命科学联合中心博士生石铭为该论文共同**作者。北京大学未来技术学院王阳明研究员为该论文通讯作者。该研究得到了北京大学伊成器、高宁、魏文胜、程和平、王显花和陈良怡实验室的指导与帮助；研究由国家自然科学基金委和国家重点研发计划“干细胞研究与器官修复”专项资助，新发现的双链脱氨酶相关应用申请专利一项。