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什么是流式细胞术?如何看流式细胞术结果中的图?

作者:生物学霸

什么是流式细胞术?

流式细胞术是一种生物学技术,英文:Flow CytoMetry,简称:FCM,用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。流式细胞术是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号,实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。


流式细胞结果图怎么看?


FCM 数据的存贮的方式是 FCS2.0(flow cytometry standard),采用列表排队(List Mode)方式。易于加工处理分析,但缺乏直观性,数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。


流式细胞术


单参数直方图


每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布,以直方图的方式来显示。在图中,横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值,其单位是道数(channel),可以是线形(line)或者对数(log)。纵坐标一般是相对细胞 / 粒子数(count)。





二维图


在二维图的中,横坐标 / 纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值,可以是线形(line)或者对数(log)。双参数图可以将样品细胞群分开,从而方便对感兴趣的细胞进行分析。

「Gate」和 「Regin」?


设门是流式细胞分析中一种重要的技术,只有通过**的设门方式,才能准确地获取和分析数据,从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。


On-line gating(threshold gating) 监测 / 获取数据;Off-line gating:分析实验数据。


散射光设门 / 荧光设门

散射光 / 荧光联合设门

多重逻辑门(组合门)多重逻辑门 G3=R1 and R2 (G3=R1×R2)

其它:G=R1 or R2 G=R1 not R2。


通常划在 101 附近)这样后期做 sample 时好看。当然也可以调到 102,103 次方。


流式图中的颜色与荧光颜色?



流式图中的颜色为区分不同细胞群而人为指定,与荧光颜色无关。


流式图中的阴/阳(N/P)如何划分?


01、如何做 M1 阴性界限?


实际上,这个 M1 的划分完全是根据阴性 (同型)对照来的。如下图:左图为同型对照,即:您所检测的物质在阴性组中的基础表达量,可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。右图即阳性组,也就是接受刺激后,功能状态下、药物作用后等。


02、阴性正好在 101 划分?


其实,我们可以人为地将电压,放大倍数调到相应的大小,使阴性的右边界在某一个值上,(通常划在 101 附近)这样后期做 sample 时好看。当然也可以调到 102,103 次方。


03、为什么要进行荧光补偿?


流式细胞分析中经常要用到 2 种以上的荧光标记抗体进行染色,而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。


「荧光补偿」这个术语是指修正荧光渗漏的过程,如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。


新上手实验的同学,可以参考上面的流式细胞实验设计、操作指南、数据解读指导,仔细阅读,在做实验的时候,按照流程一步步操作,积累经验。


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