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CRISPR体外诊断技术及行业发展分析

作者:SAM

一、CRISPR体外诊断技术概况



什么是CRISPR技术


1、CRISPR技术的定义


CRISPR的是英文Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats的缩写形式,中文意思是:成簇的规律间隔的短回文重复序列,Cas是英文CRISPR associated的缩写,意思是:CRISPR关联,合在一起简称为CRISPR/Cas系统。Cas9(CRISPRassociated nuclease)是CRISPR相关核酸酶,CCRISPR/Cas9是最一种由RNA指导,利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。 该技术是 被人们发现并加以利用, 而非为人类开发合成的 。


CRISPR-Cas9成功与否的关键在于gRNA的设计,如果gRNA和非目标区域有过多的非特异性结果,脱靶效率就会比较高,特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的区有高同源性。目前,为了提高基因组编辑的准确性,科学家对Cas9核酸酶进行了突变,突变后的Cas9只能切割DNA双链中的一条链,通过两个gRNA引导Cas9对DNA切割,可以显著提高基因组编辑的特异性,降低脱靶效应。


2、CRISPR技术原理

CRISPR技术原理图.png


CRISPR/Cas9主要由两部分组成:gRNA和Cas9蛋白。gRNA由CRISPR RNA(crRNA)与反式激活crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)组成,crRNA的一部分序列能与tracrRNA配对,形成双链RNA结构;一部分序列与靶目标互补区域,以此识别靶序列。Cas9蛋白先与gRNA形成复合体( Cas9-sgRNA ) ,使 Cas9蛋白构象变化,产生一条通道,使其更容易与DNA结合。该复合体随机碰撞DNA,若未识别到PAM序列,则会快速离开DNA,发生下一次碰撞;若识别PAM序列,Cas9蛋白的Arg1333和Arg1335会与二核苷酸鸟嘌呤结合,此时,Ser1109和Lsy1107形成磷酸锁结构,与PAM序列旁的+1位核苷酸发生相互作用,促使双链DNA解旋,利用RNA-DNA碱基互补配对原则,核对序列与crRNA的互补情况,若在种子序列出现较多错配,则序列识别过程终止,从而确保Cas9在正确的目标处发挥作用。


CRIPSR诊断技术流程图

以CRIPSR-Cas系统为平台开发的新一代诊断技术将极大地改变疾病诊断现状,从而有利于我们早期发现疾病,并进行早期治疗干预。


临床现状

大量医疗机构软硬件落后

收集检测样本

尿液、血液、粪便等

控制感染

优化临床医疗

CRISPR技术1.jpgCRISPR技术2.jpgCRISPR技术3.jpg

诊断技术

最理想的诊断技术应该是价格低廉、准确性高、快速、无需专门的设备、设施技术人员,可以对多种样品进行检测的技术.


1. 制备检测样品、释放出核酸,并避免核酸被降解

技术平台:HUDSON


CRISPR技术4.jpg

2.扩增DNA或RNA核酸

技术平台:RPA或RDA


CRISPR技术5.jpg

3. 准确发现靶标,放大检测信号

技术平台:SHERLOCK、SHERLOCK v2及DETECTR

CRISPR技术6.jpg



从原理上来说, CRISPR分子诊断方法实际上是将扩增方法与Cas蛋白的检测相结合。CRISPR检测在提高灵敏度的同时,也提高了特异性,而且降低了对仪器依赖。另外,经过方法优化,CRISPR检测也做到了多靶标、一步法定量检测、DNA和RNA相同步骤检测和适合野外偏远地区的快速分子检测。


3、CRISPR 体外诊断 技术发展历史


CRISPR技术是在20世纪90年代初发现的,并在7年后首次用于生物化学实验,迅速成为人类生物学、农业和微生物学等领域***的基因编辑工具 。


在 2015年初,中国科学院深圳先进技术研究院周文华团队提出:CRISPR体系在分子诊断领域将有巨大的应用前景和优势,其因此也作为世界范围内最早提出这一设想的课题组之一。


但 CRISPR 体外诊断技术的发展不得不追溯到 加州大学(伯克利)的 Jennifer Doudna博士 、 麻省理工张锋博士 , 二者不但在 CRISPR 诊断 技术的发明、应用上做出奠基性的贡献,还积**力于该技术的产业化和商业化。


2016年8月张锋团队在Science期刊上发表了的一篇关于一种新CRISPR核酸酶的文章C2C2 ( 即 俗称的 Cas13a ) 。 他们 意外发现 Cas13a在完成特异性切割RNA之后,能够非特异性的切割任意的单链RNA,Cas13a具有强烈的细胞毒性 。


就在张锋进行 Cas13a的研究的同时,UC-Berkeley大学的Doudna团队也在进行相同的研究。 于 同年 10 在 月 Nature上发表研究结果 —— Cas13a 非特异性切割 RNA 能够用于核酸的分子检测。


此后, 张锋团队加速了 Cas13a在核酸检测上的研究, 于 2017年4月在Science期刊上 发表 研究 成果 —— 一个基于 CRISPR/Cas13a的分子诊断 技术(简称 SHERLOCK )。


2018年2月,Doudna团队在Science期刊 上发表 研究 成果 ——除 Cas13a具有非特异性切割RNA的功能,Cas12a与Cas13a具有相似的特性,在特异性的切割目的DNA之后,能够非特异性的切割单链DNA 。 并基于此 发明了基于 Cas12a的分子诊断技术 ( 简称 DETECTR ) 。原理同 Cas13a一样, 不过 用于发光的底物是单链 DNA。


2018年4月 , 中国科学院上海生命科学研究院王金团队 在 Cell Discovery期刊上发表了基于Cas12a的分子诊断技术 。


2018年9月,中国科学院深圳先进技术研究院周文华团队在 Nature Communications 期刊上发表了研究成果 ——利用CRISPR系统效应蛋白Cas9在与靶核酸分子结合过程中独特的构象变化,高效启动针对靶核酸分子指数倍扩增的分子诊断技术(简称CRISDA)。


2018年10月, Jennifer Doudna团队LucasHarrington发现Cas14a的切割对象是单链DNA,而不是双链DNA,因而Cas14a可用在DETECTR诊断工具中。Cas12a擅长识别双链DNA,Cas13a 擅 长识别单链 RNA,Cas14a擅长识别单链DNA,因而RNA、双链DNA和单链DNA都可以检测。通过比较Cas12a和Cas14a检测单核苷酸多态性(SNP)的能力,发现Cas14a的特异性增加可实现高保真的SNP基因分型。


4、CRISPR诊断技术优势


同其它基因编辑技术相比, CRISPR有很多优势:灵活性(对不同的基因靶点只需改变gRNA序列)、高特异性、便捷性、可模块化、可编程、低成本等等 , 因此该技术正在医疗、农业和工业等多个领域被广泛开发。在医疗领域中, CRISPR技术的应用 也 主要有三个方向:治疗、科研工具 、 体外诊断( IVD)。


在体外诊断领域中, CRIS PR 技术在诸多方面均优于传统 PCR技术:

性能CRISPR 技术传统PCR技术
灵敏度优异的抗干扰性;可在复杂背景条件下,对 aM (10-18M) 浓度的靶核酸分子进行高效扩增检测抗干扰能力较差,无法实现有效扩增
特异性无需优化即可实现对极低浓度的靶核酸分子进行单核苷酸多态性 (SNP) 检测要实现 SNP检测则需通过联合测序、酶反应或者多重引物等条件来实现,成本较高、更为复杂
普适性所需的扩增引物设计简单,无需优化即可迅速实现对新位点的检测反应体系开发所需的扩增引物需经过大量优化
操作难度无需依赖仪器,仅通过简单操作,即可在 90分钟内即可完成从富集到扩增检测的全部过程;温度依赖极低需依赖多步繁琐操作,过程耗时4 小时,且对仪器控温要求极高
成本测试成本低,原材料极便宜检测每项费用约几十美元,原材料贵



5、CRISPR 体外诊断 技术应用领域


就 CRISPR技术在IVD领域来看 : CRISPR诊断特异性极好,可以检测到一个碱基的突变,非常适合早期筛查肿瘤、检测肿瘤易感基因和致病基因 ;


同时, CRISPR诊断技术操作简单、对仪器设备依赖性低、价格低廉,适合野外检测和不发达地区检测 ; 例如国内 某 兽医科研单位基于 CRISPR建立适合养殖场净化的诊断方法 , 刚果民主共和国利用 CRISPR分子诊断技术检测埃博拉病毒(Ebola virus) ;


另外, CRISPR诊断对操作者的要求低、结果可视化,因此家庭用CRISPR诊断试剂盒也是许多公司发展的方向。


二、 CRISPR诊断技术行业发展现状


1、CRISPR市场规模将达40亿,生物医学应用将日益凸显


据 美国咨询公司 Markets and Markets发布 的 CRISPR技术市场分析报告,目前,CRISPR技术主要应用在科研、农业和生物医学等方面 ; 其中, 生物医学应用将成为未来五年内增长最快的部分 , 而 基因治疗、药物发现和诊断方面的发展将推动生物医学领域的增长。 2017 - 2023年期间CRISPR技术的市场规模 在 2017年 为 5.46亿美元 , 到 2023年将增长至39亿美元 , 其 复合年增长率( CAGR)将达 44 %;CRISPR体外诊断 市场规模预计自 2020年开始将呈现快速增长的态势。


从产品和服务来看, CRISPR技术市场目前以产品为主 , 相关的酶将占据产品市场的**份额,这是 CRISPR过程中的关键成分之一。


2、CRISPR技术广泛分布于美国,中国主要集中于长三角地区


从 2018年来看,北美占据着CRISPR技术市场的**份额。如今,CRISPR技术市场的主要参与者大多集中在美国,包括Cellecta(美国)、赛默飞世尔(美国)、GeneCopoeia(美国)、Applied StemCell(美国)、Synthego(美国)、OriGene Technologies(美国)、Horizon Discovery(英国)、默克(德国)和GenScript(美国) ; 而 只有少数几家重点机构致力于 CRISPR技术的诊断应用,包括Mammoth Biosciences、Caribou Biosciences和MIT。


目前我国进行 CRISPR研发的公司主要集中在南京 、 北京和上海地区, 形成了 以江浙沪为核心 的 研发地带 。 知名公司包括金斯瑞 、 德泰生物 、 赛贝生物等 21家左右 ; 国内致力于 CRISPR技术诊断应用的机构主要有微远基因、克睿基因等。


三、 CRISPR诊断技术发展的制约因素


1、 基因编辑脱靶效应 , 精准度不够


作为潜在的医疗手段,它的精确度仍然不够。一旦基因编辑的流程启动, 而目前还没有方法可以终止基因编辑的过程,因而 就只能等待整个过程自然结束 。目前该技术中 Cas9酶是“切割”酶中最受关注的 , Cas酶切割DNA双螺旋的两条链 。 但研究表明, CRISPR/Cas9 可以击中准确目标的基因编辑中,有大约一半发生在编辑过程开始的6小时内;而在6小时后,脱靶的编辑开始变多,精准度不断降低。因此,这种“双链断裂”引起人们对切割精准度的担忧, 科学家们正在积极寻找其替代品。


2、 个体基因编码的差异性 要求个性化产品


在使用 CRISPR/Cas9基因编辑系统的时候,个体化的差异会导致基因编辑系统失效或者造成损害的情况出现。而由于与gRNA不匹配,一个碱基对所产生的基因差异性可能会导致结合效率下降,变异体也可能会导致在可能造成伤害的新位点上的结合。因此,必须在临床前研究以确保在gRNA设计阶段就考虑到基因变异并为临床翻译验证这些gRNA,最终为不同基因型患者提供“安全、有效、个性化”的个性化产品。


3、存在PAM识别序列的限制


前间区序列邻近基序( PAM)是一个位于靶DNA3’端的短核苷酸基序,可被Cas9蛋白特异性识别。化脓性链球菌可识别标准PAM NGG和非标准PAM NAG。理论上,生物基因组中NGG每隔8bp碱基出现一次;NRG则每4bp碱基出现一次。但由于不同基因序列上的差异,并非所有的基因都能有合适的PAM。分析玉米的全基因组,在有注释的外显子中仅30%能找到特异性切割位点。这表明,PAM在一定程度上限制了Cas9剪切位点的选择。为了减弱PAM对Cas9蛋白的额限制,可对其进行改造和使用Cas9直系同源酶。


四、 CRISPR诊断技术行业竞争情况分析


中外 CRISPR诊断技术公司不相伯仲,基本处于同一起跑线,当前世界上还未形成绝对成熟,以及相关领域的龙头企业,商业化和产业化均处于不断探索之中。


1、 Mammoth Biosciences


2017年Jennifer Doudna创立了Mammoth Biosciences,该公司利用CRISPR技术完成传染病、肿瘤学和基因突变方面的快速诊断 。


公司 曾从 NFX手中获得过12万美元的投资 ; 2018年8月获得了由Mayfield领投,NFX、8VC、 苹果 CEO蒂姆·库克和早期癌症筛查公司Grail前首席执行官Jeff Huber 参投的 2300万美元A轮融资 。


2、 Sherlock Bioscience s


公司于 2019年张锋 参与 成立,核心技术由麻省理工学院和哈佛大学授权,分别是基于基因编辑技术 CRISPR的诊断技术平台SHERLOCK,和基于合成生物学的分子诊断平台INSPECTR。公司基于CRISPR技术完成快速诊断,可以检测多种生物或样本类型的遗传基因,直至达到个位数的阿摩尔级 。


2019年3月获得了由 Northpond Ventures 和BV百度风投领投3500万美元的风险投资;2019年9月,从DTRA获得了约200万美元的补助金;2019年11月获得梅琳达·盖茨基金会单笔数额不详的资助金。


3、 克睿基因


公司 成立于 2016年,是一家由CRISPR基因编辑技术应用的先驱者联合创办的转化型生物科技企业 , 专注于新型医药、分子诊断领域中 CRISPR技术原创性应用的开发,致力于解决难治愈性肿瘤、复杂遗传性疾病的临床需求。


2018年8月完成由启明创投领投,清松资本、盛鼎投资共同投资 的 1700万美元A轮融资 。


4、 微远基因


公司成立于 2018年, 专注于基因科技与精准医疗方向 ,拥有两大核心技术平台,包括基因编辑技术 (CRISPR)的快速诊断平台与二代高通量测序(NGS)平台。产品研发方向为肿瘤靶向药物检测、动态监测、早期筛查和病原体的精准鉴定、耐药基因、毒力因子检测产品,其通过独立医学检验所或医院联合实验室的业务模式和平台,为大众提供临床检测服务。


2019年9月完成由火山石资本、国科嘉和基金共同领投的数亿元A轮融资。


5、 杰毅生物


公司成立于 2019年,是一家专注基因检测,以分子技术为平台的高新技术企业,致力于为客户提供感染性疾病分子诊断的整体解决方案。围绕基因编辑(CRISPR/Cas)和高通量测序(NGS)两大前沿技术路线,专注打造新一代分子诊断平台。


2020年3月 完成由比邻星创投、普华资本和体外诊断资深产业人士等联合投资 的 近亿元人民币 Pre-A轮融资。


由于,CRISPR Cas相关专利大部分掌握在美国公司手中,这些专利的授权限制和使用成本会严重制约国内相关企业的发展。


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