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CRISPR体外诊断技术及行业发展分析作者：SAM 一、CRISPR体外诊断技术概况 什么是CRISPR技术1、CRISPR技术的定义 CRISPR的是英文Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats的缩写形式，中文意思是：成簇的规律间隔的短回文重复序列，Cas是英文CRISPR associated的缩写，意思是：CRISPR关联，合在一起简称为CRISPR/Cas系统。Cas9（CRISPRassociated nuclease）是CRISPR相关核酸酶，CCRISPR/Cas9是最一种由RNA指导，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。 该技术是 被人们发现并加以利用， 而非为人类开发合成的 。 CRISPR-Cas9成功与否的关键在于gRNA的设计，如果gRNA和非目标区域有过多的非特异性结果，脱靶效率就会比较高，特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的区有高同源性。目前，为了提高基因组编辑的准确性，科学家对Cas9核酸酶进行了突变，突变后的Cas9只能切割DNA双链中的一条链，通过两个gRNA引导Cas9对DNA切割，可以显著提高基因组编辑的特异性，降低脱靶效应。 2、CRISPR技术原理
CRISPR/Cas9主要由两部分组成：gRNA和Cas9蛋白。gRNA由CRISPR RNA（crRNA）与反式激活crRNA（trans-activating crRNA,tracrRNA）组成，crRNA的一部分序列能与tracrRNA配对，形成双链RNA结构；一部分序列与靶目标互补区域，以此识别靶序列。Cas9蛋白先与gRNA形成复合体（ Cas9-sgRNA ） ，使 Cas9蛋白构象变化，产生一条通道，使其更容易与DNA结合。该复合体随机碰撞DNA，若未识别到PAM序列，则会快速离开DNA，发生下一次碰撞；若识别PAM序列，Cas9蛋白的Arg1333和Arg1335会与二核苷酸鸟嘌呤结合，此时，Ser1109和Lsy1107形成磷酸锁结构，与PAM序列旁的+1位核苷酸发生相互作用，促使双链DNA解旋，利用RNA-DNA碱基互补配对原则，核对序列与crRNA的互补情况，若在种子序列出现较多错配，则序列识别过程终止，从而确保Cas9在正确的目标处发挥作用。 CRIPSR诊断技术流程图 以CRIPSR-Cas系统为平台开发的新一代诊断技术将极大地改变疾病诊断现状，从而有利于我们早期发现疾病，并进行早期治疗干预。
从原理上来说， CRISPR分子诊断方法实际上是将扩增方法与Cas蛋白的检测相结合。CRISPR检测在提高灵敏度的同时，也提高了特异性，而且降低了对仪器依赖。另外，经过方法优化，CRISPR检测也做到了多靶标、一步法定量检测、DNA和RNA相同步骤检测和适合野外偏远地区的快速分子检测。 3、CRISPR 体外诊断 技术发展历史 CRISPR技术是在20世纪90年代初发现的，并在7年后首次用于生物化学实验，迅速成为人类生物学、农业和微生物学等领域***的基因编辑工具 。 在 2015年初，中国科学院深圳先进技术研究院周文华团队提出：CRISPR体系在分子诊断领域将有巨大的应用前景和优势，其因此也作为世界范围内最早提出这一设想的课题组之一。 但 CRISPR 体外诊断技术的发展不得不追溯到 加州大学（伯克利）的 Jennifer Doudna博士 、 麻省理工张锋博士 ， 二者不但在 CRISPR 诊断 技术的发明、应用上做出奠基性的贡献，还积**力于该技术的产业化和商业化。 2016年8月张锋团队在Science期刊上发表了的一篇关于一种新CRISPR核酸酶的文章C2C2 （ 即 俗称的 Cas13a ） 。 他们 意外发现 Cas13a在完成特异性切割RNA之后，能够非特异性的切割任意的单链RNA，Cas13a具有强烈的细胞毒性 。 就在张锋进行 Cas13a的研究的同时，UC-Berkeley大学的Doudna团队也在进行相同的研究。 于 同年 10 在 月 Nature上发表研究结果 —— Cas13a 非特异性切割 RNA 能够用于核酸的分子检测。 此后， 张锋团队加速了 Cas13a在核酸检测上的研究， 于 2017年4月在Science期刊上 发表 研究 成果 —— 一个基于 CRISPR/Cas13a的分子诊断 技术（简称 SHERLOCK ）。 2018年2月，Doudna团队在Science期刊 上发表 研究 成果 ——除 Cas13a具有非特异性切割RNA的功能，Cas12a与Cas13a具有相似的特性，在特异性的切割目的DNA之后，能够非特异性的切割单链DNA 。 并基于此 发明了基于 Cas12a的分子诊断技术 （ 简称 DETECTR ） 。原理同 Cas13a一样， 不过 用于发光的底物是单链 DNA。 2018年4月 ， 中国科学院上海生命科学研究院王金团队 在 Cell Discovery期刊上发表了基于Cas12a的分子诊断技术 。 2018年9月，中国科学院深圳先进技术研究院周文华团队在 Nature Communications 期刊上发表了研究成果 ——利用CRISPR系统效应蛋白Cas9在与靶核酸分子结合过程中独特的构象变化，高效启动针对靶核酸分子指数倍扩增的分子诊断技术（简称CRISDA）。 2018年10月， Jennifer Doudna团队LucasHarrington发现Cas14a的切割对象是单链DNA，而不是双链DNA，因而Cas14a可用在DETECTR诊断工具中。Cas12a擅长识别双链DNA，Cas13a 擅 长识别单链 RNA，Cas14a擅长识别单链DNA，因而RNA、双链DNA和单链DNA都可以检测。通过比较Cas12a和Cas14a检测单核苷酸多态性（SNP）的能力，发现Cas14a的特异性增加可实现高保真的SNP基因分型。 4、CRISPR诊断技术优势 同其它基因编辑技术相比， CRISPR有很多优势：灵活性（对不同的基因靶点只需改变gRNA序列）、高特异性、便捷性、可模块化、可编程、低成本等等 ， 因此该技术正在医疗、农业和工业等多个领域被广泛开发。在医疗领域中， CRISPR技术的应用 也 主要有三个方向：治疗、科研工具 、 体外诊断（ IVD）。 在体外诊断领域中， CRIS PR 技术在诸多方面均优于传统 PCR技术：
5、CRISPR 体外诊断 技术应用领域 就 CRISPR技术在IVD领域来看 ： CRISPR诊断特异性极好，可以检测到一个碱基的突变，非常适合早期筛查肿瘤、检测肿瘤易感基因和致病基因 ； 同时， CRISPR诊断技术操作简单、对仪器设备依赖性低、价格低廉，适合野外检测和不发达地区检测 ； 例如国内 某 兽医科研单位基于 CRISPR建立适合养殖场净化的诊断方法 ， 刚果民主共和国利用 CRISPR分子诊断技术检测埃博拉病毒（Ebola virus） ； 另外， CRISPR诊断对操作者的要求低、结果可视化，因此家庭用CRISPR诊断试剂盒也是许多公司发展的方向。 二、 CRISPR诊断技术行业发展现状 1、CRISPR市场规模将达40亿，生物医学应用将日益凸显 据 美国咨询公司 Markets and Markets发布 的 CRISPR技术市场分析报告，目前，CRISPR技术主要应用在科研、农业和生物医学等方面 ； 其中， 生物医学应用将成为未来五年内增长最快的部分 ， 而 基因治疗、药物发现和诊断方面的发展将推动生物医学领域的增长。 2017 - 2023年期间CRISPR技术的市场规模 在 2017年 为 5.46亿美元 ， 到 2023年将增长至39亿美元 ， 其 复合年增长率（ CAGR）将达 44 %；CRISPR体外诊断 市场规模预计自 2020年开始将呈现快速增长的态势。 从产品和服务来看， CRISPR技术市场目前以产品为主 ， 相关的酶将占据产品市场的**份额，这是 CRISPR过程中的关键成分之一。 2、CRISPR技术广泛分布于美国，中国主要集中于长三角地区 从 2018年来看，北美占据着CRISPR技术市场的**份额。如今，CRISPR技术市场的主要参与者大多集中在美国，包括Cellecta（美国）、赛默飞世尔（美国）、GeneCopoeia（美国）、Applied StemCell（美国）、Synthego（美国）、OriGene Technologies（美国）、Horizon Discovery（英国）、默克（德国）和GenScript（美国） ； 而 只有少数几家重点机构致力于 CRISPR技术的诊断应用，包括Mammoth Biosciences、Caribou Biosciences和MIT。 目前我国进行 CRISPR研发的公司主要集中在南京 、 北京和上海地区， 形成了 以江浙沪为核心 的 研发地带 。 知名公司包括金斯瑞 、 德泰生物 、 赛贝生物等 21家左右 ； 国内致力于 CRISPR技术诊断应用的机构主要有微远基因、克睿基因等。 三、 CRISPR诊断技术发展的制约因素 1、 基因编辑脱靶效应 ， 精准度不够 作为潜在的医疗手段，它的精确度仍然不够。一旦基因编辑的流程启动， 而目前还没有方法可以终止基因编辑的过程，因而 就只能等待整个过程自然结束 。目前该技术中 Cas9酶是“切割”酶中最受关注的 ， Cas酶切割DNA双螺旋的两条链 。 但研究表明， CRISPR/Cas9 可以击中准确目标的基因编辑中，有大约一半发生在编辑过程开始的6小时内；而在6小时后，脱靶的编辑开始变多，精准度不断降低。因此，这种“双链断裂”引起人们对切割精准度的担忧， 科学家们正在积极寻找其替代品。 2、 个体基因编码的差异性 要求个性化产品 在使用 CRISPR/Cas9基因编辑系统的时候，个体化的差异会导致基因编辑系统失效或者造成损害的情况出现。而由于与gRNA不匹配，一个碱基对所产生的基因差异性可能会导致结合效率下降，变异体也可能会导致在可能造成伤害的新位点上的结合。因此，必须在临床前研究以确保在gRNA设计阶段就考虑到基因变异并为临床翻译验证这些gRNA，最终为不同基因型患者提供“安全、有效、个性化”的个性化产品。 3、存在PAM识别序列的限制 前间区序列邻近基序（ PAM）是一个位于靶DNA3’端的短核苷酸基序，可被Cas9蛋白特异性识别。化脓性链球菌可识别标准PAM NGG和非标准PAM NAG。理论上，生物基因组中NGG每隔8bp碱基出现一次；NRG则每4bp碱基出现一次。但由于不同基因序列上的差异，并非所有的基因都能有合适的PAM。分析玉米的全基因组，在有注释的外显子中仅30%能找到特异性切割位点。这表明，PAM在一定程度上限制了Cas9剪切位点的选择。为了减弱PAM对Cas9蛋白的额限制，可对其进行改造和使用Cas9直系同源酶。 四、 CRISPR诊断技术行业竞争情况分析 中外 CRISPR诊断技术公司不相伯仲，基本处于同一起跑线，当前世界上还未形成绝对成熟，以及相关领域的龙头企业，商业化和产业化均处于不断探索之中。 1、 Mammoth Biosciences 2017年Jennifer Doudna创立了Mammoth Biosciences，该公司利用CRISPR技术完成传染病、肿瘤学和基因突变方面的快速诊断 。 公司 曾从 NFX手中获得过12万美元的投资 ； 2018年8月获得了由Mayfield领投，NFX、8VC、 苹果 CEO蒂姆·库克和早期癌症筛查公司Grail前首席执行官Jeff Huber 参投的 2300万美元A轮融资 。 2、 Sherlock Bioscience s 公司于 2019年张锋 参与 成立，核心技术由麻省理工学院和哈佛大学授权，分别是基于基因编辑技术 CRISPR的诊断技术平台SHERLOCK，和基于合成生物学的分子诊断平台INSPECTR。公司基于CRISPR技术完成快速诊断，可以检测多种生物或样本类型的遗传基因，直至达到个位数的阿摩尔级 。 2019年3月获得了由 Northpond Ventures 和BV百度风投领投3500万美元的风险投资；2019年9月，从DTRA获得了约200万美元的补助金；2019年11月获得梅琳达·盖茨基金会单笔数额不详的资助金。 3、 克睿基因 公司 成立于 2016年，是一家由CRISPR基因编辑技术应用的先驱者联合创办的转化型生物科技企业 ， 专注于新型医药、分子诊断领域中 CRISPR技术原创性应用的开发，致力于解决难治愈性肿瘤、复杂遗传性疾病的临床需求。 2018年8月完成由启明创投领投，清松资本、盛鼎投资共同投资 的 1700万美元A轮融资 。 4、 微远基因 公司成立于 2018年， 专注于基因科技与精准医疗方向 ，拥有两大核心技术平台，包括基因编辑技术 (CRISPR)的快速诊断平台与二代高通量测序(NGS)平台。产品研发方向为肿瘤靶向药物检测、动态监测、早期筛查和病原体的精准鉴定、耐药基因、毒力因子检测产品，其通过独立医学检验所或医院联合实验室的业务模式和平台，为大众提供临床检测服务。 2019年9月完成由火山石资本、国科嘉和基金共同领投的数亿元A轮融资。 5、 杰毅生物 公司成立于 2019年，是一家专注基因检测，以分子技术为平台的高新技术企业，致力于为客户提供感染性疾病分子诊断的整体解决方案。围绕基因编辑（CRISPR/Cas）和高通量测序（NGS）两大前沿技术路线，专注打造新一代分子诊断平台。 2020年3月 完成由比邻星创投、普华资本和体外诊断资深产业人士等联合投资 的 近亿元人民币 Pre-A轮融资。 由于，CRISPR Cas相关专利大部分掌握在美国公司手中，这些专利的授权限制和使用成本会严重制约国内相关企业的发展。 相关阅读
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