美格生物
MAGIGEN
咨询热线:   020-34438810   18027152056     Email: info@magigen.com
最新文章
生物技术及产业新闻

深入了解CRISPR Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas13、Cas14蛋白之间的区别

作者:美格君

CRISPR Cas蛋白家族十分庞大,目前发现和使用的主要有CRISPR Cas9、Cas12、Cas13、Cas14系列。其中,又可以分为多种亚型,例如Cas12a、Cas12b、Cas12f、Cas12i等等。


CRISPR Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas13、Cas14蛋白之间有什么不同、区别?


我们先将这些常用Cas蛋白的主要特点进行比较



Crispr蛋白向导RNAPAMTarget酶结构域切割机制
Cas9sgRNA5' NGGDNAHNH, RuvC靶DNA中的特异性钝端双链断裂DSB
Cas12acrRNA5' (T)TTNDNARuvC-like在有5' overhangs的靶DNA中特异性DSB
Cas12bsgRNA5' TTNDNARuvC-like
Cas13acrRNA/RNA2X HEPN特异性RNA切割
Cas13bcrRNA/RNA2X HEPN
Cas14asgRNA/ssDNARuvC-like在有5' overhangs的靶DNA中特异性DSB



图1. CRISPR Cas蛋白的主要区别


从图1中可以看出不同Crispr Cas酶在向导RNA、是否需要PAM和Target目标片段有不同。


向导RNA,即gRNA,也称单链向导rna(single guideRNA,sgRNA)。gRNA是人类人工制造的,自然界中不存在。这种gRNA设计基于自然存在的crRNA和tracrRNA。 核苷酸1–32是天然存在的crRNA。 核苷酸37-100是天然存在的tracrRNA。在两个片段之间添加了一个GAAA接头,使它们成为单个RNA片段。


除了以上的一些区别,Cas蛋白在作用机制方面也有不同。


cas9cas12cas13区别.jpg


Cas9蛋白的作用机制:


CRISPR Cas9系统包括一个gRNA(或sgRNA) 和 Cas9 核酸酶,它们共同形成一个核糖核蛋白(RNP)复合物。Cas9 蛋白识别的 PAM序列是 5'-NGG-3',其中 N 代表任意核苷酸。如果 PAM 序列匹配正确,并且 gRNA 成功地与目标位点结合,那么 Cas9蛋白会在 PAM序列上游约 3-4个核苷酸进行 DNA双链的切割。


Cas12蛋白的作用机制:


CRISPR Cas12系统在向导RNA的引导下识别含PAM的dsDNA,然后促使靶标dsDNA解链,解链后的靶标dsDNA中的靶标链(TS)与向导RNA形成Rloop,近而释放出Cas12中的RuvC的活性位点;而刚刚解链后的靶标dsDNA中的非靶标链(NTS)此时就会被释放出的活性位点的RuvC切割;这一切割的结果造成靶标DNA的解旋,释放出的靶标dsDNA的TS被RuvC切割;当Cas12完成对靶标dsDNA中的TS和NTS的切割后(顺式切割),会释放出dsDNA,而此时空间被留出来的RuvC的活性位点,一旦有ssDNA进入,都会被切割(反式切割)。


CRISPR Cas12a蛋白和CRISPRCas12b蛋白是CRISPR Cas蛋白 Class2 V型中的亚型,V-A cas12a, 又叫cpf1; V-B cas12b, 又称 c2c1。Cas12b和Cas12a的主要区别是:


1. 核酸酶结构域不同,Cas12b蛋白的结构域是RuvC;Cas12a蛋白的结构域是RuvC和Nuc。


2. 向导RNA不同。Cas12b需要crRNA和tracrRNA;Cas12a只需要crRNA,不用tracrRNA。


3. 酶切方式不同。Cas12b酶切7个交错核苷酸;Cas12a酶切的是交错末端,5' overhangs。


4. 应用技术不同。Cas12b蛋白应用的技术是HOLMES v2;Cas12a蛋白应用的技术是DETECTR和HOLMES。


Cas13a蛋白的作用机制:

CRISPR-Cas13系统与crRNA、底物结合形成三元复合体后,Cas13蛋白被激活,此时Cas13蛋白不仅能切割底物RNA,还能切割游离在环境内的任意单链RNA。Cas13a蛋白和Cas13b蛋白是RNA酶,基于Cas13a和Cas13b的检测需要RNA聚合酶的转录步骤。


Cas13a只需要24个碱基的crRNA,它通过富含尿嘧啶的茎环结构与Cas13a分子相互作用,并通过Cas13a的一系列构象变化来促进目标的切割。与Cas9一样,Cas13a也能容忍crRNA与目标序列之间的单个错配,不过若存在2个错配,那切割效率就大大降低。它的PFS序列(相当于PAM序列)位于间隔区的3’端,由A、U 或C碱基组成。


Cas13a还有一个特别之处,那就是Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列指定的RNA目标,它就转入了一种酶促“激活”状态,这时它将结合并切割其他的RNA,而不管它们是否与crRNA同源,或是否存在PFS。这一点与Cas9截然不同。对于细菌而言,这种性质是有意义的。若细菌被噬菌体感染,它能够激活程序性细胞死亡或休眠状态,以限制感染在整个群体中的传播。


像Cas13a一样,Cas13b仅需要单个向导RNA就能找到靶标,并且从遗传学的角度是可编码的。此外,Cas13b能够同时靶向多个RNA转录本。但Cas13b也有一些独特的特点,表明它与Cas13a是不同的。这些特性使得Cas13b更适用于微调基因功能。


Cas14a作用机制:

Cas14a核酸酶是一种内切核酸酶,其在tracrRNA:crRNA(或sgRNA)的引导下,特异结合并切割靶标ssDNA,且无需PAM位点。相比于其他的Cas蛋白,Cas14蛋白的分子量普遍较小(400-700aa);与Cas12类似,Cas14a也可以结合靶标核酸并激活其ssDNA反式切割活性,从而被应用于靶标核酸的分子检测;与Cas12不同的是,Cas14a只能结合ssDNA靶标,因此经过扩增富集的靶标核酸需使用T7核酸外切酶进行处理,且其中一条扩增引物需要使用磷硫酰化修饰以确保T7核酸外切酶仅切割其中一条链,从而留下ssDNA靶标链以用于Cas14a介导的分子检测。


目前,人们也把Cas14蛋白归为Cas12一类


相关阅读

国内外环装RNA合成技术大全

CRISPR Cas12a蛋白和CRISPRCas12b蛋白有何不同?

CRISPR Cas13a切割原理

分享到:
会员登录
登录
我的资料
我的收藏
留言
回到顶部