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新手入门,蛋白纯化常见问题解答

作者:蛋白纯化

蛋白提纯是一个一个比较复杂的过程。对于新手来说,可能会遇到一些问题。

蛋白提取纯化常见问题

1、蛋白纯化标签应该如何选择?

在进行蛋白表达时,选择合适的标签有利于蛋白的纯化,促进蛋白的可溶性,因此了解几种常用的蛋白纯化标签很重要。

一般来说,常用的蛋白纯化标签主要有His tag、MBP tag、GST tag、Strep tag、NusA tag等。

这些蛋白纯化标签之间有什么不同?各有什么优点缺点?


His tag(组氨酸标签)融合蛋白是目前最常见的表达方式,其优点是标签小,纯化步骤简便,纯化条件温和,能纯化可溶性/包涵体蛋白,一般不会影响蛋白的功能结构,且可以产出大量的目标蛋白,但该标签不适合易氧化蛋白或膜蛋白的纯化。


MBP tag(麦芽糖结合蛋白标签)可以减少目标蛋白的降解,增加蛋白的表达量和稳定性,提高表达产物的水溶性,但标签较大,对蛋白的结构和功能会有一定影响。


GST tag(谷胱甘肽巯基转移酶)的洗脱条件温和,有助于保持蛋白功能活性,适合pull-down 检测,具有很好的线性动态范围,但分子量较大,可能会影响蛋白质的功能和下游实验,如果蛋白不可溶,很难用变性的方法进行纯化。


Strep tag(strep标签)能产出高纯度(95%)的目标蛋白,而且可以保持目标蛋白活性,主要是因为它的纯化流程温和。其次,它能进行变性条件下的纯化。用于WB/ELISA,可侦测目标蛋白。另外,还可固定目标蛋白,检测蛋白质交互作用,或更进一步用以筛选治疗用蛋白质,或是工业用酵素。但是,Strep tag纯化系统的价格相对His tag而言较高,所产出的目标蛋白数相对较少。


NusA tag(转录终止/抗终止蛋白标签)不具有独立的纯化标签功能,需要和其他标签(如His标签)联用,可提高蛋白质的溶解性,但由于分子量较大,对蛋白下游应用会有影响。

2、重组蛋白A琼脂糖凝胶FF能一次纯化大量血清IgG吗?例如:几十毫升, 如用环氧活化的琼脂糖凝胶纯化血清 IgG,先要偶联其相应配基,如抗体或蛋白A是吗?这里琼脂糖凝胶用环氧活化的意义是什么?

几十毫升如果一次纯化也就用几十毫升的重组蛋白A,琼脂糖凝胶 FF 就可以, 也可以分两三次纯化,这都没有问题。如果是想做血清中的抗体纯化,也可以把抗原偶联到环氧活化琼脂糖凝胶上, 这样得到的抗体更纯, 一般不选择蛋白A, 环氧活化便宜, 而且相成的键很稳定, 没有非特异吸附,是个不错的方法。


3、利用疏水性质,用反相HPLC方法分离的原理是什么?

反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的,极性越强先出来,极性越弱越后出,洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱,反相是极性强的流动相吸附,降低它的极性洗脱,选择主要是依据填料的特点、以及样品本身的特点而改变的。


疏水的填料疏水基团密度只是反相的10%左右, 其他的都是亲水的, 而反相正好相反, 它的表面全是疏水基团,因此,疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱, 反相一般用甲醇水乙睛水吸附, 洗脱是逐渐增加有机溶剂的量。由于以上的原因, 疏水比反相要温和, 蛋白一般不变性, 由于填料多为琼脂糖凝胶, 所以,蛋白回收率高,而反相适合做分析比较多, 也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽, 反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因,疏水色谱是纯化蛋白的一个有力的工具。

4、通过His标签纯化的蛋白,杂带比较多,如何改进?

(1)如果纯化的是上清,蛋白酶会部分降解目标蛋白,可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。

(2)可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度,以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。

(3)杂蛋白和目标蛋白结合,可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。

5、镍柱使用中出现棕色是怎么回事?

出现这样的情况,主要是缓冲液中 DTT的影响,DTT 会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下,镍离子会被 DTT还原生成棕色的沉淀;所以,所有镍柱的生产商都强调要尽量避免 DTT 的参与,一般的镍柱耐受小于 5mM DTT,推荐缓冲液中不要超 2mM DTT。

6、镍柱堵了怎么办?

(1)柱子发生堵塞,可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致,所以样品一定要高速离心,并过0.22或者0.45的膜。

(2)上清纯化时,蛋白发生变性,有絮状物产生,尽快加入 1-2mM DTT (上清样品处理要在冰浴中进行),还不行的话,加尿素变性,使其在变性环境下。

(3)样品处理时的料液比不要太小,否则黏度大,有可能导致蛋白析出或变性,料液比要在 1/10-1/15 之间较适宜。

7、如何处理样品,可使其初步提纯(如何洗去蛋白的自身带)?

(1)上清样品处理,要加入去污剂,蛋白酶抑制剂,还原剂,还要注意温度及超声破碎的参数。

(2)去大肠杆菌自身带(两条 30KD-40KD)可用非变性缓冲液超声悬浮(加入去垢剂),离心 6000r/min,30min,10℃。(若效果不够可继续上述步骤)。

(3)大肠杆菌包涵体的洗涤,可用包涵体洗液多洗几遍,也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解,可选取其中纯度**的。

(4)可用硫酸铵沉淀法,初步提纯。


8、没能纯化到带 His标签的蛋白,蛋白都流穿了(未挂柱)?

(1)超声的功率不对(太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放),策略:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶。

(2)样品或者是结合缓冲液不正确 ;策略:检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份。

(3)组氨酸的标签没有完全的暴露 ;策略:在变性条件下,用 8M 脲,6M 盐酸胍,1%SDS,并加入 1-2mMDTT 进行纯化。

(4)His 标签丢失,可以采取一些策略:

        策略1:WB或者 anti-his的抗体检查 His是否表达,上游构建,改变 his-tag 的位(C-terminal orN-terminal),必要时增加 his 个数(常用 6-10 个);

        策略2:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间;

        策略3:改变螯合的金属离子,寻找到**的结合金属离子。


Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6 标记的重组蛋白质的首选金属离子,也是一般最常用的离子。

蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响,包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH,因此,一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 来筛选不同的金属离子。

9、蛋白挂在柱子上洗脱不下来,怎么解决?

(1)洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强), 策略:用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出**的洗脱条件。

(2)降低 PH 的方法洗脱的,因为若 PH 低于 3.5,会导致镍离子脱落策略:改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱。

(3)蛋白已沉淀在柱上策略:减少上样量和孵育的时间,试用去污剂(1%-2%Tritonx-100)或改变 NaCl 的浓度,或在变性条件下洗脱(用 8M 脲,或 6M 盐酸胍),最终也可在洗脱 Buffer 中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸钠进行洗脱。

(4)非特异性疏水或其他相互反应策略:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如,2%Triton X-100)或增加 NaCl 的浓度。

10、纯化过程中,蛋白出现了浑浊,怎么办?

(1)出现浑浊,说明蛋白处在不稳定的环境中、或者自身就不稳定,所以,要检查缓冲体系是否正确,环境是否低温,或在缓冲液中加入还原剂 DTT。

(2)加入肌氨酸钠,迅速使蛋白变性,消除浑浊现象。


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化学修饰热启动 Taq 1.0 DNA 聚合酶(带基础 buffer)A017S250U, 5U/µl385
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CRISPR Cas14aC015S100pmol/盒1280
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