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PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR的区别、优点、缺点

作者:PCR技术

PCR技术

PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR

作为生物专业的学生,PCR实验是必不可少的内容。但是对于许多新同学来说,关于PCR的专业术语有很多,比如PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR等等。这一些列的PCR有什么不同?今天,美格君就和大家简单介绍一下。

一、PCR是什么意思?

PCR的中文意思是聚合酶链反应。它是英文Polymerase Chain Reaction的缩写,是一种分子生物学技术,可在体外扩增特定的DNA片段。

PCR技术是什么时候发明的?

1983年,美国人Mullis首先提出PCR设想,1985年他的团队成功的实现了PCR聚合酶链反应,1993年,Mullis因此获得诺贝尔化学奖。

自问世以来,PCR技术在生物科学、分子诊断、亲子鉴定、法医鉴定和犯罪调查等领域发挥了重要作用,并成为迄今为止最重要的技术之一。随着时间的推移,PCR技术经历了演化和革新,目前已经发展到第三代,即普通PCR技术、qPCR实时荧光定量PCR技术和dPCR数字PCR技术。


PCR的演变.jpg

图1. PCR技术的演变   (Lee NY., 2018)


二、PCR扩增的原理和步骤

PCR一种DNA扩增技术,与DNA的体内复制类似。它利用DNA聚合酶酶和引物(短DNA片段)以及被扩增的DNA模板来复制和产生大量的DNA片段,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。。PCR涉及一个循环的温度程序,包括DNA的解离,引物的结合和扩增以及DNA的合成步骤。这种技术可用于许多应用,包括基因分析、疾病诊断和遗传学研究。使用PCR可以在短时间内从极少的DNA样本中扩增出足够多的DNA片段,使其可以进行分析和研究。

PCR技术的基本反应步骤.jpg

图2. PCR反应的基本步骤


PCR包括三个基本反应步骤:

变性、退火和延伸。

①模板DNA的变性denaturation:为了使模板DNA能够与引物结合,将模板DNA加热至大约95℃左右的高温一段时间,让其解离成单链状态。

②模板DNA与引物的退火annealing,由称复性:当温度降至约55℃时,引物会与模板DNA的单链以碱基互补配对的方式结合。

③引物的延伸extension:然后将温度调至大约72℃,这是DNA聚合酶所需的**反应温度。在Taq DNA聚合酶的作用下,DNA模板与引物结合,并根据碱基配对和半保留复制原理,在磷酸到五碳糖(5'→3')的方向上合成一条新的互补于模板DNA链的半保留复制链。经过变性、退火和延伸循环多次后,待扩增的目标基因就能被扩大几百万倍。


三、常见PCR的种类有哪些

PCR根据其应用领域可以分为不同的分类。首先,有基础性的PCR分类,包括普通PCR、逆转录PCR和荧光定量PCR。普通PCR用于扩增DNA片段,逆转录PCR用于从RNA转录成DNA,而荧光定量PCR可以用来准确测量DNA或RNA的浓度。其次,还有特定领域中常用的PCR分类,如实时荧光PCR、多重PCR和数字PCR。实时荧光PCR可以实时监测PCR反应的进行,多重PCR可以同时扩增多个目标序列,而数字PCR则可以准确计算样本中目标序列的拷贝数。在分子生物学和医学研究中,这些不同类型的PCR分类都有其各自的应用和重要性。

由于PCR专业名词比较相似,2009年首次发布的《定量实时PCR实验出版的最低信息》MIQE指南提出了标准化的缩写。


1. 普通PCR

普通PCR又称为一代PCR,通过使用普通PCR扩增仪来扩增目标基因,然后使用琼脂糖凝胶电泳来对扩增产物进行定性分析。


2. qPCR,实时荧光定量PCR, Real-time Quantitative PCR

qPCR是一种用于快速和精确测量DNA或RNA样本中的特定目标序列数量的分子生物学技术。该技术结合了PCR和荧光探针技术,通过监测PCR反应过程中荧光信号的数量来实时测量目标序列的数量。与传统的末端定量PCR方法相比,实时荧光定量PCR具有更高的灵敏度和特异性,并且可以在PCR反应过程中实时监测反应进程,提供实时定量结果。实时荧光定量PCR在许多领域都有广泛的应用,包括基因表达分析、病毒检测、遗传变异分析等。它的快速、准确和高通量的特点使其成为现代分子生物学研究中不可或缺的工具。

实时荧光定量PCR是一种在PCR反应中加入荧光染料或基团,并通过收集荧光信号实时监测每个循环中扩增产物量变化的PCR技术。该技术也被称为Real-Time PCR或二代PCR。最终,通过使用标准曲线和CT值来定量分析待测样品。qPCR技术用于检测病原体的存在,并确定目标DNA序列的拷贝数。

qPCR又主要有两种常用方法:SYBR Green法和TaqMan探针法。

①SYBR Green荧光染料法:SYBR Green是最常用于荧光定量PCR的染料,它能与所有双链DNA结合。在PCR反应中添加SYBR Green,它会与双链DNA结合并产生荧光信号。因此,所有的荧光信号量与反应中双链DNA的量成正比,荧光强度会随产物增加而增加。然而,由于染料与双链DNA的结合是非特异性的,可能导致假阳性结果的产生。

荧光染料法的优势包括:价格较低、使用方便、适用于各种DNA模板,具有很好的通用性,同时还具备高灵敏度的检测能力。

荧光染料法的不足之处:可能会出现假阳性结果,需要进行熔解曲线分析以确认扩增产物的特异性;需要不断改进反应体系,以减少非特异性扩增的发生;不适合进行多重qPCR检测。

②TaqMan荧光探针法:TaqMan技术是一种非常常用的定量方法,也是临床检测中最常用的方法之一。在PCR扩增过程中,我们会加入一对引物,并且同时加入一个特异性的荧光探针。这个探针是一个寡核苷酸,其5'端标记有一个荧光报告基团(Reporter, R),而3'端标记有一个淬灭基团(Quencher, Q)。当探针完整时,报告基团发射的荧光信号会被淬灭基团吸收,因此我们无法检测到任何荧光信号;但是在PCR扩增过程中,即在延伸阶段,探针会被Taq酶的5'→3'外切酶活性切断,导致报告基团和淬灭基团分离,这样,报告基团发射的荧光不再被吸收,从而可以在荧光监测系统中接收到荧光信号。换句话说,每当扩增一条DNA,就会形成一个荧光分子,PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步,PCR产物越多,累积的荧光信号就越多,荧光强度就越强。

荧光探针法的优点:具有强大的特异性检测能力;高灵敏度;非常适合于进行多重qPCR检测;在PCR之后无需进行任何处理,从而节省时间和原料成本。

荧光探针法的缺点:需要根据不同的序列,合成不同的探针;探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性,定量时容易受试剂和酶性能的影响;淬灭难以彻底,本底较高;检测结果很难判断实际的扩增特性。


根据Cao等人(2020)的研究,图3显示了荧光染料法和荧光探针法的工作原理。

荧光染料法和荧光探针法的工作原理.jpg

图3. 荧光染料法和荧光探针法的工作原理


注意: 多重PCR,又称为多重引物PCR或复合PCR,是一种新型的PCR扩增技术,在一个反应体系中加入两对以上的引物,同时扩增出多个核酸片段。


3. dPCR,数字PCR,Digital PCR,或Dig-PCR

数字PCR是对PCR的改进,也称为第三代PCR。它是一种精准的核酸定量检测技术,利用泊松分布原理,将核酸样品分配到许多独立且平行的微反应单元(以纳升为单位)。每个反应室平均只有一个或没有目标DNA分子,然后加入荧光信号进行扩增。通过这种方式,可以精确计数靶标核酸分子,从而提高检测灵敏度和准确度。


4. RT-PCR,逆转录PCR

RT-PCR,也被称为反转录PCR,,“RT”代表逆转录(Reverse transcription),是一种用来检测RNA分子的PCR方法。它通过使用逆转录酶将RNA转录为互补的DNA,然后使用PCR聚合酶链反应来扩增和检测这些DNA分子。逆转录PCR广泛应用于基因表达分析、病毒检测、诊断以及直接克隆特定基因的cDNA序列等领域。

在RT-PCR中,首先使用反转录酶将单链RNA逆转录成cDNA,随后以cDNA为模板进行扩增合成目标片段。可以使用总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物作为模板,但关键是确保RNA中没有RNA酶和基因组DNA的污染。一般使用一步法或两步法来进行反应,一步法是将RT反应和PCR反应在同一个试管中进行,而两步法则是将这两个反应分开依次进行。


5. RT-qPCR,实时荧光定量逆转录PCR, Real-time RT-PCR, 是一种用于检测和定量RNA的方法。它结合了逆转录PCR和荧光探针技术,可以准确测量RNA的数量,并在PCR反应过程中实时监测反应的进行。这种技术广泛应用于生物医学研究、临床诊断和基因表达分析等领域。

RT-qPCR使用mRNA或总RNA作为模板,先进行反转录以生成cDNA,然后再通过荧光定量PCR进行定量检测分析。相比于RT-PCR只能进行定性分析,RT-qPCR的优势在于能够进行定量分析。类似于RT-PCR,RT-qPCR定量分析RNA的方法有两种:一步法和两步法。这两种方法都需要先将RNA反转录为cDNA,然后再将其作为qPCR扩增的模板,一步法中的RT和qPCR在同一试管中进行,例如Magigen OneStep RT-qPCR Kit,减少了实验污染,提高了效率;而两步法中的RT和qPCR则按顺序分开进行。


2020年由Soler等人提出的研究中,展示了RT-qPCR的一步法和两步法,如图4所示。

一步法和二步法RT-QPCR实验.jpg

图4.


小结

1. PCR通常是指聚合酶链式反应,它使用双链DNA作为模板,dNTP作为底物来进行双链DNA的定性扩增。

2. qPCR和实时PCR都是指实时荧光定量PCR,它们使用cDNA作为模板,以dNTP作为底物,用于对扩增出的DNA进行定量分析。

3. RT-PCR是逆转录聚合酶链式反应的缩写,利用由mRNA逆转录成cDNA后作为模板,以dNTP为底物进行DNA扩增,是PCR的一种变种。其结果只能用于定性分析,无法进行定量测量。

4. RT-qPCR是实时荧光定量逆转录PCR的简称。它是将总RNA或mRNA首先逆转录成cDNA,然后使用dNTP作为底物进行qPCR定量分析的一种组合技术。


四、不同PCR方法优点缺点


分类优点确定
传统PCR

技术成熟、操作简单,成本低;标准完善;扩增效率高、灵敏度好 ,产物可回收用于其他试验

操作繁琐;特异性和敏感性低;容易污染,只能定性不能定量,容易发生交叉污染,, 存在虚假阳性或虚假阴性结果的可能性
qPCR特异性和灵敏度高;操作简便;可定量分析成本高;产物不可回收
RT-PCR 和RT-qPCR可与所有的 RNA 类型一起使用RNA 容易降解:RT步骤可能会增加时间和污染的可能性
dPCR绝对定量;更高的敏感性和特异性、高精度,高通量、扩增效率高, 可检测低拷贝数目标   仪器较昂贵;数据分析复杂,操控技术要求较高;费时

表1   不同PCR方法的优缺点详述


美格小TIPS:

MIQE指南是科研实验中遵循的一项质量标准,全称为“Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments”,直译为“发表定量实时聚合酶链反应实验证据的最低信息要求”。它是提高定量实时聚合酶链反应(qPCR)实验的质量与可重复性而制定的指南。


美格生物部分热销逆转录酶价格

RT-PCR逆转录酶产品名称编码规格出厂价格
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Magicscript RNA酶抑制剂 100A002S100µl320
Magicscript 耐热逆转录酶 III 500A003M500µl6320
Magicscript 耐热逆转录酶 III 100A003S100µl1580
一步法RT-qPCR预混液 100TA005S100T798
一步法RT-qPCR预混液II 100TA014S100T798


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pcr污染的主要污染源有哪些?pcr污染原因及解决方法?

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