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利用cas13a反式剪切RNA g4 的特性实现RNA的非扩增检测

作者:Magigen

CRISPR/Cas13蛋白

CRISPR-Cas系统的反式剪切能力被广泛用于核酸检测(NAT)。先前的研究主要集中在利用Cas13a蛋白对ssRNA的反式剪切活性,并借助复杂的策略(如RPA、链置换反应、自催化反应、液滴微流控)来提高灵敏度,其中引入的额外操作步骤增加了检测系统的复杂度以及对操作人员有较高的要求,限制了其在现场快速检测中的应用。为了实现快速、高灵敏度的核酸检测,中国科学院精密测量院、湖北省妇幼保健院团队发表了“Leveraging Cas13a’s trans-cleavage on RNA G-quadruplexes for amplification-free RNA detection”的文章。在这项研究中,作者深入研究了CRIRSP/Cas13a可以反式剪切RNA G-四链体(rG4s),并将其作为CRISPR-Cas13a诊断中传统ssRNA报告分子的替代方案。与传统的ssRNA相比,Cas13a对rG4具有更高的反式剪切活性。在此基础上成功构建了基于Cas13a和rG4的检测体系,在1 h内即可实现SARS-CoV-2临床样本的免扩增检测。






1. CRISPR-Cas13a被证实具有反式剪切RNA G4的活性。通过FRET (Fig. 1b)、CD (Fig. 1c)、Urea-PAGE (Fig. 1d)、smFRET (Fig. 1e)和NMR (Fig. 1f) 等多种技术充分证实Cas13a可以反式剪切RNA G4。

Cas13a被证实具有反式剪切RNA G4的活性

图1 CRISPR/Cas13a被证实具有反式剪切RNA G4的活性

2. 比较CRISPR-Cas13a对RNA G4和ssRNA的反式剪切效率。酶促反应动力学研究表明Cas13a对RNA G4有更快的反式剪切效率(Kcat/Km),尽管RNA G4在单位时间内的转换数(Kcat)要低于ssRNA,但由于RNA G4具有更小的Km,使得Cas13a与RNA G4之间的亲和力更大,带来更高的催化效率。分子对接实验表明TERRA G4与Cas13a有更低的对接打分,说明TERRA G4与Cas13a之间有更高的亲和力(Fig. 2)。

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图2 Cas13a对rG4和ssRNA的反式剪切效率的比较

3. rG4作为报告分子用于新冠临床样本的免扩增检测。我们发展了以rG4为报告分子的Cas13a新型检测方法,在非扩增情况下对合成RNA的灵敏度达到了0.02 pM。进一步选用新冠标准物质(购自国家计量院标准物质中心)进行测试,检测灵敏度达到了12 fM。最后将发展的新方法用于新冠病毒临床样本的测试,在免扩增的条件下成功测得了24个病人样本的结果,与临床结果RT-qPCR结果一致(Fig. 3)。

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图3 以rG4为报告分子的Cas13a检测体系用于新冠样本的免扩增检测

4. 基于G4/hemin的免标记检测体系的建立。G4作为生物传感的重要信号分子,可以快速响应多种刺激(如ThT、hemin、Pb2+等)。我们进一步发展了基于G4/hemin的免标记检测方法以取代传统ssRNA中高昂的标记成本。G4/hemin复合物具有类过氧化物酶活性,在H2O2存在下可以催化氧化还原反应,产生电化学信号(Fig. 4a)。结合便携式电化学检测平台有潜力实现现场即时检测(point of care testing, POCT)。基于G4/hemin的电化学检测平台对新冠标注物质的检测灵敏度可达 3 fM。

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图4 以rG4为报告分子的CRISPR Cas13a检测体系用于新冠样本的免扩增检测


本研究首次发现并确认了CRISPR-Cas13a具有反式剪切rG4的能力。通过酶促反应动力学和分子对接实验进一步验证了Cas13a在rG4上相比于ssRNA表现出更强的催化能力。基于此,成功建立了以rG4为报告分子的简单、快速且高灵敏度的Cas13a核酸检测平台,在标记和无标记模式均表现优异。与传统的以ssRNA为报告分子的方法相比,我们的方法在成本、操作便利性和可扩展性方面均具有明显的优势。首先,我们的方法实现了无需标记的直接检测,大幅降低了整体测试成本。其次,该方法消除了对核酸扩增的依赖,简化了测试系统,提高了操作简便性。第三,基于rG4的Cas13a检测系统通过响应各种刺激(例如,金属离子、hemin、ThT)显示出了良好的可扩展性。总体而言,我们的工作为Cas13a对RNA的反式剪切机制提供了新的见解,并扩展了基于CRISPR的诊断方法的应用范围。


论文链接:https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/cc/d3cc06238d



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文章分类: 科技最前线
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