一种CRISPR/Cas14a辅助磁分离的增强型结核分枝杆菌的视觉检测平台的建立

肺结核是由结核分枝杆菌引起的一种传染病，严重威胁着人类健康。目前，检测结核分枝杆菌的金标准为细菌培养后的显微镜观察，该方法的检测时间较长，需要4~6周。WHO认可的用于临床检测MTB基因以及利福平耐药性检测的PCR方法-GeneXpert MTB/RIF的检测时间为2小时左右，而且需要使用昂贵的实验室设备以及专业人员的操作。因此，在特定条件下，如医疗条件较差的地区快速而又简单的核酸检测对该疾病的诊断和病原体筛查具有重要意义。目前已有几种检测 MTB 的等温扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚圈扩增(RCA)、杂交链式反应(HL)、指数放大反应(EXPAR)。其中EXPAR因其具有放大效率高、操作简单等优点被广泛的应用。然而，对于 EXPAR，作为引物的目标核酸相当局限于短序列或包含酶切释放的3’末端的序列，这在一定程度上限制了 EXPAR 用于检测核酸的普遍性。

日前，重庆医科大学杨晓兰教授建立了一种基于toehold的Three-Way Junction（TWJ）介导的等温放大级联CRISPR/Cas14用于检测MTB的磁分离增强视觉检测平台（C-TEC）。该检测平台的模板设计为Y−X−Y结构，可直接触发含Toehold的TWJ的形成和多重指数信号放大。与传统的TWJ 的X−Y模板相比，Y−X−Y模板的设计大大提高了扩增效率，缩短了检测时间，简化了样品的添加。在**条件下，C-TEC平台在90 min内肉眼检测结核分枝杆菌16S rDNA低至50 fM，使用UV−vis在520 nm处的检测限为20.71 fM。该检测平台可用于检测结核分枝杆菌的临床分离株的同时也显示出检测RNA病毒的可行性。该成果以“ Toehold-Containing Three-Way Junction-Initiated Multiple Exponential Amplification and CRISPR/Cas14a Assistant Magnetic Separation Enhanced Visual Detection of Mycobacterium Tuberculosis”为题发表在ACS Sensors期刊上。

示意图1   C-TEC 生物传感器检测结核杆菌的原理示意图。首先，靶标作为桥梁，可以通过相邻的杂交招募TWJ Primer和TWJ Template，形成具有toehold的TWJ-Complex I，然后在聚合酶的帮助下，通过引物沿着含有Nt.BstNBI缺口识别位点的模板延伸形成TWJ-Complex II。相反，在没有靶标的情况下，引物和模板不能可靠的相互配对。TWJ的延伸，切割以及链置换的重复循环（Cycle 1）形成大量的放大产物作为触发链。释放的触发链与游离的TWJ模板杂交以启动EXPAR（Cycle 2）。释放的触发物与TWJ-Complex II的3′端结合，并沿着模板延伸用于链置换，释放靶标和延伸引物的复合物，该复合物可以识别游离模板，形成新的TWJ-Complex II用于另一个扩增循环（Cycle 3）。最后，扩增的ssDNA产物被CRISPR/Cas14a中的sgRNA识别，并激活Cas14a以非特异性切割生物素标记的ssDNA S1底物。Biotin-S1被链亲和素磁珠捕获（MB-S1）并且与附着在AuNPs上的SH-S2特异性结合（AuNP-S2）。无靶标存在时，MB-S1上的Biotin-S1未切割与AuNP-S2杂交，在磁分离后上清液是无色的。有靶标存在时，MB-S1上的Biotin-S1被激活的CRISPR/Cas14a裂解，使AuNP-S2保留在上清液中，颜色为红色。

图1   TWJ的形成和扩增的验证。（A） TWJ复合物及经10 min扩增反应得到的产物的PAGE图。1~8：target，TWJ primer，TWJ template的终浓度为200 nM, Vent（exo-）为 0.02 U/μL ；9~10：target，TWJ primer，TWJ template，Vent (exo-)，Nt.BstNBI 的终浓度分别为5 nM, 10 nM, 50 nM, 0.02 U/μL, and 0.3 U/μL。（B）多重指数放大的PAGE图。1~9：target, TWJ primer, TWJ template, Y′, dsDNA of template, and extended primer的终浓度为200 nM；Vent (exo-) 和 Nt.BstNBI 的终浓度分别为0.02和0.3 U/μL。（C）以SYBR Green I 染料作为荧光指示剂，TWJ诱导的指数扩增反应的实时荧光信号。（D） TWJ级联CRISPR/Cas14a的实时荧光分析。（E）Cas14a-sgRNA与产物Y‘作为触发链的杂交结构。(F)Y−X−Y模板和X−Y模板的结构图。

图2 Cas14a检测的ssDNA报告基因的优化。（A）Cas14a对长度分别为12和6 bp的报告基因的反式裂解活性。（B）Cas14a对4个均聚物报告基因（ploy A、ploy T、ploy C和ploy G）的反式裂解活性（最终触发浓度为100 nM）。（C）不同浓度下16S rDNA对F-TEC的实时荧光光谱。（D）Cas14a切割报告基因30 min后的荧光强度与16S rDNA对数浓度之间的线性关系。

图3   用冷冻法制备AuNP-S2探针。（A）通过冷冻法制备的裸AuNPs、AuNP-S2、冷冻下的AuNP和盐溶液中的裸AuNPs的照片和紫外−可见吸收光谱。（B）以合成Y′为触发激活的CRISPR/Cas14a反式切割biotin-S1为基础的MB-S1下拉AuNP-S2的可行性。（C）在不同浓度下对目标16S rDNA进行磁分离后的照片以及（D）紫外−可见吸收光谱。（E）紫外-可见吸收（A520）与靶16S rDNA浓度之间的线性关系。（F）C-TCE检测平台的特异性。

图4 .真实样品的（A）紫外吸光度（A520）和（B） PCR结果。（C）用不同浓度的MTB DNA进行磁性分离后的上清液的照片。（D）紫外−可见吸收光谱。（E）A520与MTB DNA浓度的对数之间的线性关系。

图5 .（A）从其他临床分离株中提取的未知浓度MTB DNA的紫外可见吸收光谱（B）qPCR与该方法的比较（C）不同菌株的紫外可见吸收和（D）荧光强度 (a) S. aureus, (b) E. coli, (c) A. baumannii, (d) K.peneumoniae, (e) S. faecalis, (f) M. tuberculosis, (g) S. aureus+M. tuberculosis, (h) E. coli + M. tuberculosis, (i) A. baumannii + M. tuberculosis, (j) K.peneumoniae + M. tuberculosis,   (k) S. faecalis + M. tuberculosis基因组DNA的浓度均为 1 ng/μL。

作者报道了一种具有敏感性和特异性检测MTB的方法，该方法不依赖于信号读出仪器，肉眼观察下的检测限可以低至50 fM。该方法的建立不仅扩展了CRISPR/Cas14a检测的新策略，而且还促进了核酸检测的小型化，使经济、快速和可现场部署的即时护理诊断成为可能。

本方法采用的CRISPR/Cas14a来自于广州美格生物科技有限公司。

DOI: 10.1021/acssensors.3c01622.

https://pubs.acs.org/doi/epdf/10.1021/acssensors.3c01622

杨晓兰，女，重庆医科大学检验医学院、临床检验诊断学教育部重点实验室教授，博士生导师。2006年获得重庆医科大学药理学专业博士学位。2021.12-2022.03在香港科技大学化学系访问学习。

研究方向为：

1. 生物标志物分析新方法与新材料；

2. 酶抑制剂的设计合成与筛选；

3. 磁分离选择性指数富集快速筛选组合合成配体及天然产物混合物中高亲和力配体。

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