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细胞培养的基本方法详解和注意事项

作者：细胞培养师

细胞培养的基本概念

什么是细胞培养

细胞培养, 英文是cell culture，是指从体内组织取出细胞，在体外模拟体内环境下，使细胞生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。

细胞培养的目的与用途

一、基础研究

(1) 药物作用机理

(2) 基因功能

(3) 疾病发生机理

二、科学研究:

(1) 新药筛选:如药效研究,中药有效成分筛选等.

(2) 疫苗研究与开发:如肝炎疫苗, 艾滋病疫苗，肿瘤疫苗等.

(3) 基因工程药物与细胞工程药物的研究与开发

(4) 单克隆抗体制备

细胞培养常用的设施器材

设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。

器材：

1、玻璃器材

玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等。

2、塑料器材

多孔培养板（6,12,24,48,96孔）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。

3、橡皮器材

橡皮制品（**是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。

4、金属器材

剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头

5、其他物品

纱布、注射器、针头、滤头

细胞培养的环境条件

1、适宜的温度和PH

37℃， pH7.2~7.4。

2、气体环境

95%空气+5% CO₂ ; 适宜的湿度（无菌，水不能干掉）。

（CO₂ ：细胞生长所必需的成分, pH值维持，最低不能低于1%。）

3、营养物质

细胞培养基中含有：N 源、 C源、无机盐、维生素、 H₂ O；

常用的细胞培养基： DMEM， RPMI-1640， BME， M199 等。

4、无菌条件

紫外消毒、空气过滤、无菌滤头，高压灭菌、严格操作。

培养细胞的分类

按照是否贴壁划分：

贴壁细胞：大多数属此类细胞，如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞等。

悬浮细胞：主要为取自血、骨髓、脾的细胞，如白血病细胞。

按照传代次数划分：

原代细胞：即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。（也有人把传代10次之内的细胞统称为原代细胞。）

细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如HeLa细胞、CHO细胞等。

原代细胞培养

原理：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

如何培养原代细胞？

原代培养方法：消化培养法、组织块培养法。

原代消化培养法

（1）处理组织：用Hanks液漂洗组织2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

（2）剪切：将组织切成2~3毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。

（3）消化：置于37℃温箱消化，每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

（4）分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心收集细胞，弃上清。

（5）加入适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。

（6）培养：置于37℃， 5%CO₂ 温箱培养。

原代组织块培养法

（1）剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成1mm³ 小块。

（2）摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

（3）轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时） ，使小块微干涸。

（4）培养：从微箱中取出培养瓶， 46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

细胞的传代

什么是细胞传代？

细胞代传，英文是 cell passage, 是指随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将原有细胞分成几部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养，这个过程就称为传代。

细胞传代方法：

1、悬浮细胞传代

2、贴壁细胞传代

悬浮细胞传代：

（1）收集细胞悬液，培养；

（2）离心（1000转/分， 2分钟）；

（3）弃上清；

（4）加入新鲜培养基重悬细胞；

（5）按照适当比例接种到新的培养皿；

（6）补足培养基；

（7）放于温箱培养。

悬浮细胞传代-1.png

图1. 悬浮细胞传代流程

贴壁细胞的传代：

（1）吸去陈旧培养基，并用PBS清洗细胞表面；

（2）加入胰酶消化细胞；

（3）加入新鲜培养基终止胰酶消化；

（4）将细胞吹打下来，收集，离心；

（5）弃上清；

（6）加入新鲜培养基重悬细胞；

（7）按照适当比例接种到新的培养皿；

（8）补足培养基；

（9）放于温箱培养。

贴壁细胞的传代-1.png

图2. 贴壁细胞传代流程

细胞的换液

悬浮细胞换液：收集细胞悬液、离心、弃上清、加入新鲜培养基重悬、补足培养基。或者直接从旧瓶吸取一定细胞悬液加入新瓶，补足新鲜培养基即可。

贴壁细胞换液：弃去陈旧培养基、 PBS清洗细胞表面、加入新鲜培养基。

细胞的冻存

悬浮细胞的冻存：

1、配制冻存液（胎牛血清：二甲基亚砜 9:1），每个冻存管需要冻存液1ml。

2、收集细胞悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入 - 80℃冰箱，第二日转存于液氮中。

贴壁细胞的冻存：

1、配制冻存液。

2、弃去陈旧培养基， PBS清洗细胞表面，胰酶消化，终止消化，吹打细胞，收集悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入 - 80℃冰箱，第二日转存于液氮中。

美格提醒细胞冻存的注意事项：

1、冻存液要**配置。

原因一：二甲基亚砜（DMSO）在加入血清时会产热损伤细胞。

原因二：如果先用血清重悬细胞，再加入DMSO，则局部DMSO浓度过高，会对细胞造成严重损伤（DMSO在室温下对细胞有害），影响日后的复苏。

2、冻存时要求细胞状态良好， **是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。

3、**限度的减少DMSO在室温下和细胞接触的时间。

4、冻存时要缓慢降温（慢冻），用细胞冻存盒可以做到每分钟降低1℃，细胞冻存盒应先放在4 ℃预冷，以减少细胞和DMSO在室温接触的时间；如果没有冻存盒，则采用程序降温法。（4℃冰箱40min， -20℃冰箱30-60min，置于-80 ℃过夜，次日转入液氮。）

细胞的复苏

悬浮细胞和贴壁细胞的复苏方法一样，区别在于复苏后死细胞的清除方法。

细胞复苏流程：

1、取一支离心管，加入3ml的新鲜培养基备用。

2、取出冻存的细胞，于37℃的温水中， 1min之内迅速融化。

3、迅速将解冻后的细胞加入预先准备好的离心管中， 1000转/分钟，离心1分钟。

4、弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞。

5、接种到培养皿（瓶）内，补足培养基，放入温箱培养。

复苏后死细胞的清除方法：

悬浮细胞：细胞复苏后，每2天按照2:1或3:1的比例传代一次，大约1周后，细胞生长状态良好。

贴壁细胞：细胞复苏后6h（此时已有细胞贴壁），吸去培养基（含有大量死细胞），重新加入新鲜培养基。

美格君提醒细胞复苏的注意事项

1、细胞复苏原则：快速融化（快融）。

2、尽量减少室温下DMSO和细胞接触的时间。

① 预先准备好离心管并加入新鲜培养液；

② 在1分钟之内将细胞融化；

③ 立刻将融化后的细胞倒入离心管中。

3、复苏时，离心时间不宜过长， 1分钟即可，长时间离心会对细胞造成损伤，降低细胞存活率。

4、死亡的细胞应尽快清除掉，否则会影响存活细胞的状态。

5、如果复苏不成功，更可能是因为冻存或保存过程中出现问题。

细胞污染时的处理

有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。

若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。

1、使用抗生素

污染后清除用药需采用大于常用量5～10 倍的冲洗法，于加药后作用24～48 小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。

2、加温处理

将污染的组织培养物放在41℃培养18 小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能**限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。若先用药物处理后，再以41℃加温处理效果更佳。

其他注意事项

1、细胞房要定期擦拭：包括地面、桌面、超净台等，先用自来水擦拭，再用消毒液（3‰ 的来苏尔或者新洁尔灭）擦拭，之后打开紫外灯，照射2h。

2、细胞培养箱定期灭菌：将培养箱中的铁架取出，高压灭菌，箱内壁用75%酒精擦拭，再用消毒液擦拭，紫外照射过夜。

3、及时更换CO 2 罐和HEPA过滤器，确保培养箱中有充足的无菌水。

4、及时补充液氮，不可使细胞露出液氮表面。

5、进入细胞房要更换无菌服，带好手套、口罩、鞋套等。