如何判断细胞是否被污染?细胞污染的表现

作为一名科研人，细胞培养是一个必备的技巧，但是并非每个人都能熟练掌握，特别是在实验中出现突发情况，比如日夜照顾的宝贝细胞被污染了？

细胞被污染了怎么办？该怎么处理？接下来我们针对各个类型的污染一起学习和分辨一下。

细胞污染通常是指细胞培养中的生物污染，主要类型有细菌污染、支原体污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染等。不同的类型表现各不相同。

1、细菌污染

细胞被细菌污染的特征

肉眼观察特点：

◆ 细菌污染时细胞培养基可能在4-6小时呈现混浊。

◆ 有时稍加震荡，便会有很多混浊物漂起。

◆ 背景脏乱差，而没有被细菌感染的则背景干净。

显微镜下观察特点：

◆ 细菌污染的细胞低倍镜下观察不到正常细胞形态，黑色沙粒状布满细胞间隙或培养基，或背景有大量黑点，高倍镜下可见杆状或球状的细菌在培养基中游动。

需注意，在污染初期，细菌常成群存在，不一定会有明显的运动，此时需引起警惕。

图1. 细菌感染细胞

受细菌污染的细胞形态将会发生怎样的变化呢？

细菌污染可能造成细胞增殖缓慢或形态上的改变（多角、多核等），胞质中产生空泡、细胞漂浮凋亡，细胞被毁容。

显微镜下如何区分细菌菌体与细胞碎片？

菌体与细胞碎片的区别(见图1)

菌体小而密，细胞碎片大而稀；

菌体较规则，细胞碎片不规则；

如何处理被细菌感染的细胞？

细菌的克星是抗生素

以下是几个经典的细菌污染案例：

图2. 球菌和杆菌感染细胞

2、 真菌污染

被真菌感染细胞的特征

真菌污染的细胞一般培养液清亮，不变色。比较容易发现，肉眼可见点状菌落，淡黄色或者白色漂浮在培养基表面。镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，像珊瑚状，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。

肉眼观察特点：

◆ 真菌污染最短3天才能长出椭圆形的霉斑。

◆ 霉斑往往会漂浮在培养液表面，随着时间逐步扩大。

显微镜下观察特点：

念珠菌

◆ 有些真菌呈类似棉花絮状的漂浮物。

◆ 若是念珠菌会呈卵圆状，在细胞周边生长。

根霉菌

◆ 早期并不会使得培养基变黄变浑浊，但在显微镜下可观察到菌丝体。真菌形成的菌丝呈丝状，管状，树枝状，串珠状。

酵母菌

◆ 细胞被污染后，仍可生长，长时间细胞的活力状态会变差。

◆ 梅雨季时的污染率会提高。

◆ 呈卵圆状酵母菌增殖到一定规模，形成团簇状的真菌群。

如何处理被真菌感染的细胞？

真菌的克星-抗生素

以下是几个经典的真菌污染案例：

- 根霉菌污染 -

- 酵母菌污染 -

- 白色念珠菌污染 -

图3. 真菌感染细胞案例

3、支原体污染

细胞被支原体感染的特征

细胞被支原体污染后，培养液一般会浑浊。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。

支原体污染特征：

◆ 增殖减慢

◆ 上清液清澈

◆ 背景干净

◆ 细胞形态异常（拉丝、铺展）

◆ 细胞轮廓不清，边界模糊；凋亡细胞过多

◆ 更换新的培养液，细胞状态没有恢复

图4.    支原体感染的细胞出现变化，出现A. 拉丝、 B. 铺展、C. 模糊不清等现象。

如何处理细胞培养中的支原体感染？

选择支原体检测试剂和支原体杀除试剂。

但是，一旦细胞感染了支原体，是很难根除的，往往要丢弃细胞。

发现支原体污染，**的方法是丢弃感染的细胞培养瓶。在培养的细胞不可替代或非常昂贵的情况下，有一些方法来拯救培养的细胞。

支原体清除剂（Mycoplasma Removal Agents -MRA）是喹诺酮类抗生素的衍生物，青霉素、链霉素的联合用药。MRA可用于洗涤细胞培养物。根据感染的严重程度，需要几周到几个月的传代培养。这些方法不能保证完全清除支原体，但可以消除大部分支原体污染，是最后的选择。治疗的时间会影响细胞的生长和活力。如果支原体对细胞培养产生了**性的损害，那么它是不可修复的。

4、黑胶虫污染：

细胞被黑胶虫感染的特征：

关于黑胶虫的分类，学术界没有明确的定义。低倍镜下观察时可见黑色小点，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去，在液体中活跃游动、旋转梭动。培养液不浑浊，对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失。复苏或传代时往往会出现黑胶虫污染，并且与细胞呈现此消彼长的现象。从黑胶虫污染细胞样本中分离得到黑胶虫，然后从黑胶虫中提取基因组DNA进行基因测序及分析，鉴定出的黑胶虫为无色杆菌属(Achromobacter)。

图5.   黑胶虫

如何处理被黑角虫感染的细胞？

黑胶虫污染顽固，要消除黑角虫可以使用黑胶虫清除剂，其所含有的多肽活性成分，相比传统抗生素有效清除黑胶虫；清除周期短，视黑胶虫污染程度通常3-6天可有效根除。

5、病毒污染：

细胞被病毒污染的特征

细胞被病毒污染极为隐蔽，很难用常规的方法检测到。受病毒污染的细胞液通常清亮无变化，大多数受病毒污染的细胞不会产生形态变化及细胞病理现象，少部分病毒会造成细胞变圆、肿胀，脱落。

病毒的主要来源是动物血清或者细胞系，常见于杂交瘤细胞。

组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

如何处理被病毒感染的细胞？

一旦怀疑细胞被病毒感染，可用血细胞吸附试验、免疫荧光抗体法及电子显微镜法有效检出病毒。

通常病毒物污染的清除是十分困难的，可以重新引入高质量的细胞株。

对于确定污染的细胞**的办法就是及时丢弃，积极排查细胞污染的原因。

6、细胞交叉污染

由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染，即细胞交叉感染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。

细胞交叉污染的特征：

即不同的细胞混杂在一起。

细胞交叉污染的鉴定方法：

同种属：STR鉴定，多等位基因数大于3个。需考虑本身的遗传背景，例如，EA.hy 926为融合细胞，本身就包含两套遗传信息。

不同种属：PCR法，对种属特异性基因进行扩增，不同种属产物大小不同。

细胞交叉污染的处理方法：

建议重新引种。

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