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全面解读RNA干涉(RNAi):机制、应用与未来趋势

作者:Magigen

什么是RNA干涉?

RNA干涉(RNA interference, RNAi) 是一种天然存在于生物体内的基因沉默机制。它通过特定的小双链RNA(dsRNA)高效且特异地阻断特定基因的表达,促使mRNA降解,从而使细胞表现出特定基因缺失的表型。RNAi技术不仅为生物学研究带来了革命性的变化,还成为了功能基因组学和反向遗传学研究中的重要工具。2002年,《Science》杂志将RNAi技术评为当年的十大科技突破之一,彰显了其在科学界的影响力。

RNAi的发现历程

RNAi最初由Mello和Fire在哺乳动物细胞中发现,但其机制最早是在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中被揭示的。当时研究人员发现外源引入的dsRNA导致了系统性的基因抑制。这一发现提示可能存在一种活性中间体促进了基因沉默。这些中间体包括Dicer酶和由siRNA分子与高度保守的Argonaute蛋白(特别是Argonaute-2, AGO2)组成的RNA诱导的沉默复合体(RISC)。

RNAi的分子机制

siRNA介导的基因沉默机制可以分为两个主要阶段:转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PTGS)和转录前基因沉默(Transcriptional gene silencing, TGS),两者均具有特定的抑制效应。

细胞内的dsRNA被一种名为Dicer的核糖核酸酶识别并切割成21到23个碱基对长度的小双链片段,3'端有2个核苷酸的突出端。这些切割产物被称为小干扰RNA(siRNA)。siRNA包含一条乘客链(passenger strand)和一条引导链(guide strand),这两条链通过一个活性蛋白复合体——RNA诱导的沉默复合体(RISC)连接在一起。当与RISC结合后,引导链被导向目标mRNA,并由切割酶Argonaute-2在相对于siRNA引导链5'端的第10和11个碱基之间将其切割成小片段。这样,siRNA就能中断mRNA的翻译过程。

miRNA介导的基因沉默机制则通过与特定靶mRNA的3'非翻译区(3'UTR)互补结合,影响mRNA的稳定性,从而抑制蛋白质的翻译或干扰多肽链的合成。图1展示了这些过程的概览。

美格生物siRNA的结构原理-1.jpg

图1:siRNA和miRNA介导的基因沉默机制示意图

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该图概述了siRNA和miRNA如何通过识别和切割目标mRNA来实现基因沉默的过程,以及它们在转录后和转录前水平上的作用机制。

这一发现不仅加深了我们对基因表达调控的理解,也为疾病治疗提供了新的思路。通过精准设计siRNA和miRNA,科学家们能够特异性地抑制致病基因的表达,为遗传性疾病和癌症等疾病的治疗开辟了新的路径。随着研究的深入,RNAi技术有望成为未来医学领域的一种重要工具。


RNAi的过程可以概括为几个关键步骤:


  1. dsRNA的生成:当外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内时,会生成一些dsRNA。这些dsRNA会被细胞质中的核酸内切酶Dicer识别并切割成21-25个碱基对长度的小干扰RNA(siRNA)。

  2. siRNA的成熟:siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成单链形式,通常保留反义链与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。

  3. mRNA的降解:形成的RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区特异性结合,并在其结合位点切割mRNA,导致mRNA的降解。

  4. 信号的放大:siRNA不仅能够引导RISC切割同源的单链mRNA,还可以作为引物与靶RNA结合,在依赖RNA的RNA聚合酶(RdRP)的作用下合成更多的dsRNA。新合成的dsRNA再次被Dicer切割,产生大量的次级siRNA,从而放大RNAi的效果。

RNAi的特点

  1. 高效性:即使使用低浓度的dsRNA,RNAi也能有效地抑制目标基因的表达。

  2. 高度特异性:RNAi只会降解与dsRNA序列同源的mRNA,不会影响其他基因的表达。

  3. ATP依赖性:RNAi过程需要ATP供能,没有足够的ATP,dsRNA对靶基因的抑制作用会减弱甚至消失。

  4. 可传播性:在植物中,RNAi信号可以在细胞之间通过胞间连丝或维管组织传播;而在动物中,RNAi信号的扩散则需要特定蛋白参与。

  5. 可遗传性:RNAi效应可以遗传给子代,表现出孟德尔遗传模式。

植物RNAi表达载体的构建

构建植物RNAi表达载体通常包括以下步骤:

  1. 目的片段的克隆:使用特定酶切位点的引物,以植株DNA为模板进行PCR扩增,然后将PCR产物克隆到T载体上。

  2. 表达载体的构建:正义基因片段和纯化的质粒片段连接;带有正义基因片段的质粒载体与反义片段连接。

  3. 载体的设计与优化:如采用带内含子的ihpRNA载体,其沉默效率比普通hpRNA高出许多。选择适当的启动子也很关键,例如在禾本科植物中使用泛素启动子。

影响RNAi载体构建的因素

  1. 内含子的作用:带有功能性内含子的载体能更有效地介导基因沉默。

  2. 启动子的选择:不同的启动子对基因表达水平有不同的影响。

  3. 目的片段大小:一般认为300 bp到600 bp大小的片段较为理想。

RNAi技术的应用与展望

RNAi技术作为现代基因组研究的一个强大工具,对于了解作物生长发育的内在规律、调控有益性状的高效表达以及沉默有害基因具有重要意义。此外,RNAi技术在农业领域的应用,如开发抗病、抗虫、高产、优质的作物品种,显示出了巨大的潜力。随着研究的深入和技术的进步,RNAi将继续推动生物学和医学领域的发展。



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