HEK293T细胞培养传代方法和常见问题解决方法

作者：细胞传代

如何培养HEK293T细胞

● 细胞名称： 293T(人胚肾细胞)

● 细胞别称： Hek293T; HEK-293T; HEK 293T; HEK-293-T; HEK 293 T; 293-T; 293 T; 293T; Human Embryonic Kidney 293T; 293tsA1609neo

● 生长特性：贴壁

● 培养体系：DMEM,HIGH GLUCOSE(GIBCO CAT:11995,或同配方) +10%胎牛血清(南美级别）

● 冻存液配方： DMEM,HIGH GLUCOSE+10%FBS+10%DMSO

● 培养环境：空气，95%；二氧化碳 (CO2)，5%

● 传代方式：消化30s

● 换液频率：2~3天换液1次

● 注：培养基变黄时需及时换液。

● 细胞简介：

293T细胞最初称为293tsA1609neo，是293 [HEK-293]细胞株插入了SV40 T-antigen的温度敏感基因形成的高转衍生株。293T细胞能够复制携带SV40复制区的载体，当用于生产逆转录病毒时，会产生高滴度病毒。293T细胞已广泛用于逆转录病毒生产、基因表达和蛋白质生产。

293T细胞特性

1、细胞贴壁性较差,容易飘起来;

2、增殖迅速,倍增时间约为20h;

3、融合率不可过高, 需要及时传代。

293T细胞培养传代要点

1、细胞贴壁性较差,容易飘起来,37°C静置可重新贴壁。换液时注意不要用力摇晃培养瓶,否则有可能会把细胞摇下来。

2、细胞容易消化,消化下来的细胞容易成团,要吹打吹散。否则传代后细胞会成团生长,不均匀,影响实验结果。

3、当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维持细胞良好的生长状态。

4、随着传代的次数增加,293T细胞会出现生长状态下降,出现突变等情况。所以要在细胞购进时就进行大量冻存,以保证实验的稳定性和持续性。

正常状态的293T细胞

图1. 正常状态的293T细胞

1、为什么293T细胞传代后聚团严重？

● 胰酶消化操作不当导致细胞聚团。

● 消化过度或吹打过猛导致细胞受伤严重，破损的细胞碎片容易粘连聚团。

● 消化时细胞融合率太高，成片脱落，将不容易被吹散，容易聚团。

● 鉴于该细胞贴壁疏松，普通0.25%胰酶消化时间控制30s-60s；吹打动作轻柔，充分分散；细胞融合率达到80%-90%即可传代，不可长的太满。

2、培养过程中细胞碎片较多怎么处理？

2.1. 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议使用合适的培养条件。

2.2. 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞代谢产物，可以先吸走培养基后用PBS润洗清除，再加新的培养基继续培养。润洗不能清除的可以换液清洗后等细胞密度70-80%左右消化处理细胞，消化完成后加完全培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。再加5ml PBS重悬细胞，再离心后，用完全培养基重悬接种到新的培养皿。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗几次。

3、细胞具体消化时间是多久？

每个客户用的胰酶活力及消化步骤、试剂都是不一样的，不能完全规定消化时间，以实际消化效果和客户经验为准。

4、细胞培养瓶是怎么包被的？

细胞培养瓶包被方法有很多，例如多聚赖氨酸、明胶、鼠尾胶原等，不同的包被原理和效果都不太一样，具体可以根据实际实验室条件选择合适的包被材料。注意包被后应及时使用，包被后放的时间越长效果越来越差的。

市面上也有特殊处理的培养瓶可以选择，常规TC处理或者corning的cellbind型号培养瓶都是不错的选择。

5、细胞培养过程中出现聚团现象怎么处理？

● 细胞传代过程中建议尽可能吹散细胞，并在显微镜下确认细胞基本分散后再接种细胞；

● 细胞培养建议使用优质培养体系并保证温度、湿度、二氧化碳浓度适宜，能有效避免细胞吹散后在贴壁时再聚团的现象，也可以减轻细胞聚团后无法重新摊开生长的症状；

● 培养过程中轻微聚团可以稍微延长消化时间并在消化终止后将细胞悬液静置1-2min，让大团细胞下沉后尽量吸取上层的分散细胞传代，聚团过于严重的建议重新培养或者更换培养体系。

6、为什么293T换了血清批次后聚团严重？

● 血清批次间存在差异。293T细胞本身有聚团生长特性，但严重聚团可能是由于受到血清里的某些因子刺激。

● 先用血清试用装，试用效果好，可购买和血清试用装批次相同的正装，有效避免批间差对细胞的影响。

7、为什么293T细胞转染病毒后凋亡严重？

● 在排查了方法步骤和转染试剂，依然没有改善的情况下，可排查一下转染前的营养体系，尤其是血清批间差带来的影响。很多同学说前期培养细胞形态正常呀，其实细胞形态学只是鉴别细胞是否健康的一个外在指标，还要结合细胞其它指标对细胞健康进行评定（比如倍增时间，存活率）。

● 通过更换血清批次，再进行转染实验并观察转染后的效果，比较分析出原因。

8、细胞密度怎么计算的？

严格意义上，细胞密度需要收集细胞悬液计数细胞数量，但在实际培养过程中，并不需要为了精确控制细胞数量而消化细胞计数。因此，常用的细胞密度指细胞相对于**生长密度的比值，贴壁细胞可以粗略的用细胞所占培养容器底面积百分比表示，即显微镜下观察培养容器底部，有细胞的区域占总区域的百分比值，当然这种表达方式受限于单个细胞生长不同密度时所占面积不同导致并不严谨，但也是相当直观、简便的表现细胞状态的一种方式；