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逆转录PCR、RT-PCR实验从入门到精通作者：Jones 如何进行RT-PCR实验？今天美格君邀请了Jones博士就这个议题，与大家一起探讨。 一、本次RT-PCR实验目的学习和掌握逆转录、RT-PCR基因扩增技术和操作方法，并深刻理解逆转录、RT-PCR基因扩增技术在功能基因克隆与载体构建过程中的重要性。 二、RT-PCR实验试剂和材料大肠杆菌DH5a、Trizol试剂、逆转录试剂、PCR相关试剂、PCR产物克隆试剂、氯仿、异丙醇、DEPC水等。 三、实验器材 PCR仪、移液枪、台式低温离心机、恒温水浴锅、恒温培养箱、电泳仪、研钵、紫外分光光度计、移液器和吸头、硅烷化的PCR小管、DNA扩增仪、琼脂糖凝胶电泳所需设备(例如：电泳槽、电泳仪) 、一次性手套。 四、逆转录RT-PCR实验原理什么是PCR技术？ PCR，polymerasechain reaction，即聚合酶链反应链技术，PCR技术利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性，这个循环操作可以在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍。 PCR技术的特点1. 高度特异性 2. 高度敏感性 3. 操作简便 4. 适用广泛 PCR三个过程
图. PCR反应原理 PCR反应体系构成
PCR反应循环的主要参数 预变性: 92℃-95℃, 2-5分钟 变 性: 92℃-95℃, 30秒-1分钟 复 性: 40℃-60℃, 20秒--2分钟 延 伸: 70℃-75℃, 30秒--3分钟 循 环: 30-40次 总延伸: 72℃, 7分钟 PCR引物设计原理PCR引物长度在15-30bp, GC含量在45-55%之间。 Tm=4(G+C)+2(A+T) 3'端不能与引物内部互补, 以免形成二级结构。两个引物各自的3'端不能互补,以免形成自身扩增。引物必须经过GenBank查询, 证实没有与其他非目的DNA有高度互补以后, 才能使用。
PCR用途PCR主要用途包括: 1.目的基因的克隆： 利用特异性引物克隆；利用简并引物克隆 2.基因的体外突变： 采用随意设计的引物, 在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造 3.基因表达分析 4.DNA的微量分析检测： 个人识别，亲子鉴定
逆转录PCR, 又称RT-PCR RT- PCR, ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction, 即逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 RT-PCR原理RT-PCR提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物, 利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板, 进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。 首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。 作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。 RT-PCR用途 该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。RT-PCR技术灵敏，而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
图. RT-PCR原因原理图
**链合成
如何选择反转录酶1、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2、禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3、Thermusthermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4、MMLV反转录酶的RNase H突变体：商品名为SuperScript 、SuperScriptⅡ、Magigen MagicScript II、MagicScrpt III。此种酶较其它酶能将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 四、RT-PCR实验步骤1、RNA的逆转录 A. 用1.5ml的离心管混匀下列试剂(TaKaRa公司):
B. 在PCR仪进行下列条件的变性, 退火反应 65 ℃ 5分钟, 冰上急冷 C. 在上述管中配制下列反转录反应液(Magigen, NEB):
D.将管子置于42℃水浴中反应1小时。1小时后，在70℃反应10-15分钟，终止反应。放置在-20℃冰箱中保存。 2、PCR 以逆转录的cDNA为模板，用目的基因引物进行PCR。PCR扩增体系为：
扩增条件以引物特性而定。 PCR条件： 94℃变性5分钟后开始以下循环 • 94℃变性反应50秒 • 58℃退火反应50秒 • 72℃延伸反应1分钟 • 进行24个循环 • 最后72℃反应7分钟 • 4 ℃冷却恒定。 3、电泳检测PCR产物 采用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量（取10μl扩增产物） 、引物扩增的特异性及长度 。并可根据标准DNA的量，粗略计算 PCR产物的总量。本次实验PCR产物长度： Os L29-m-PCR( A):340bp: 引物序列L29-m : up: 5’-TgCgTgTTCgCgCCCTACTT-3’; low:-5’-gCCACCTgCGTCTTCgCCTg-3’ GCCACCTGCGTCTTCGCCTGCGCCACCTGCACCTGCAGCGTCGCCAGCTGCGGCATCCGTGTGCTAAGT TAGCTCGCCGGCGAGTGATCGATCGATCGCGAGGGGTTTAAGAATTTGTAATTACCTGCTGCTGCAGCG CGAAGATGTGGGCGACGCAGCCGTAGACGGGGTCGCGCAGCCTGGCCTGCGCCTCGTAGGTGACGGT GGCGGCGACCTCGCTCCGGTCGCCCGGCGCCACCTGCTGCAGCAGCTTCGCCGCGTTGCTGGCGCCGA ACACCTTGTGTATCGCCGCGAACTGCGCCGCCCCGTCCTCCGCGCAGAAGTAGGGCGCGAACACGCA 是 Os L29基因ORF中间一段, 可用于RNAi载体构建 L29-PCR( D) :550bp 引物序列L29 : up:- 5’- gctgccaatggcgtcgtcggg-3’; low:-5’-TCATTCCTCCTgCTCgCCgAA-3’ TCATTCCTCCTGCTCGCCGAAGCAGTACATGTCCTGCAGCGACGTCGACCCGTCGGAGCGCGGCGCGC TGTAGCAGCCGGAGCTCTGCGTCGAGGTCATCGTCGACTCGTGCTCAATCTGCCACGCCTGCTGCTGCT GCTGCTGATGCTGAAGGAGAGGGTTCCCAGCCGTCAGCATGCCGGCCGCCGCCAGCGTCTGCGCCACC TGCGTCTTCGCCTGCGCCACCTGCACCTGCAGCGTCGCCAGCTGCTGCTGCAGCGCGAAGATGTGGGC GACGCAGCCGTAGACGGGGTCGCGCAGCCTGGCCTGCGCCTCGTAGGTGACGGTGGCGGCGACCTCG CTCCGGTCGCCCGGCGCCACCTGCTGCAGCAGCTTCGCCGCGTTGCTGGCGCCGAACACCTTGTGTATC GCCACGAACTGCGCCGCCCCGTCCTCCGCGCAGAAGTAGGGCGCGAACACGCACTCCGCCGCGCACTT GCGCCGCAGGAACTTGCACGCCCCGCACGGCGACCCCGGCACGCCGCCCACTCCCGACGACGCCATTG GCAGC PCR实验注意事项：1.PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 2.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 3.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 4.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 5.PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的产量。 实验后应该思考的问题和经验总结：1. 降低退火温度对反应有何影响? 2. 延长变性时间对反应有何影响? 3. 循环次数是否越多越好?为何? 4. 如果出现非特异性带, 可能有哪些原因? 建议大家先思考，再参考后面的经验总结。 实验结果 Dl2000
PCR经验总结： 1. 降低退火温度对反应有何影响?退火温度越高，断开氢键的热能越大，引物与模板越不易结合。反之，退火温度越低，越容易形成氢键，进行退火。 所以当温度高时，只有碱基匹配程度高的，也就是模板与引物形成配对数越多的引物，才能结合到模板上，这样扩增出来的条带最少，甚至只有一条，也就是引物和目的序列的完美匹配，因此特异性越高。反之，若退火温度低，引物和模板匹配低时，也能稳定存在，那么模板上可能存在很多区域能和引物上的少量碱基匹配，进行引发，因此dna条带会很多，非特异带增加。 特异带是指你的目的带。非特异带是pcr中扩增出的非目的带。退火是指温度下降，单链DNA与引物结合的过程。温度过低，可造成引物与模板之间只需有一小段可以互补配对就能配对，造成非特异性产物增加。而温度高时，需要引物与模版之间有较长的互补配对序列才能相互配对，特异性增强。 2. 延长变性时间对反应有何影响?变性时间延长会导致酶活性的降低。 3. 循环次数是否越多越好?为什么?虽然，在一定范围内，随着反应循环次数的增加，产物会增多；但超过了一定的次数就不好了。因为再次循环都有高温到低的温度变化，聚合酶的活性有限，而且一般体系中引物和原料的量也不会是无限供应的。随着反应的进行，酶会逐渐失活、dNTP等原料会逐渐消耗掉。 另外循环次数过多，产物间可能会形成较为复杂的结构，影响其作为模板的效率，因此循环次数不是越多越好，一般PCR反应的循环不超过35次。一般设置30-35个循环是比较合适的。 4. 如果出现非特异性带, 可能有哪些原因?造成非特异性带的原因可能有： 1)、引物设计不合理，出现发夹结构或二聚体； 2)、退火温度不合适； 3)、聚合酶质量不好； 4)、有污染； 5)、引物不纯或过量； 6)、模板过量。 相关阅读 |
