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逆转录RT-PCR实验原理与实战操作指南作者：Magigen RT一般有两种含义： 1，最常用的意思：RT，reverse transcription，英文"逆转录"的缩写 2，现在也有人这么解释：RT，RealTime, 英文"实时"的缩写。 这里我们要讲的是逆转录RT-PCR技术。 逆转录RT-PCR原理什么是逆转录RT-PCR技术？ RT- PCR，英文名为 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，即逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。这项技术使用的逆转录酶来自逆转录病毒，是一种能按照碱基互补配对原则，以脱氧核糖核苷酸为底物，以寡居dT为引物，把mRNA转换成相应DNA的酶，由于该酶的效果与中心法则（DNA所承载的生物信息表达顺序应该是DNA-RNA-蛋白）顺序相反，故而有'逆转录'之称。 由于逆转录反应使用了引物和模板，也是聚合酶链式扩增，故称为RT-PCR。 逆转录RT-PCR应用RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA 病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA序列（complement DNA）。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术更灵敏，更易于操作。 逆转录RT-PCR提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物，利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增合成目的片段，而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR提取的RNA主要是rRNA，即核糖体RNA，但很少有人用它做些什么，倒是含量较少的mRNA，即信使RNA是中心法则所述的遗传信息表现的中转站，所以我们要把微量的信使RNA弄出来，更重要的是，RNA太容易分解了，环境中无处不在的RNA酶，以及其容易被水解的特点啊，我们不得不尽快把珍贵的信使RNA转化成稳定的形式，于是就有了RT-PCR。 作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，最关键是：确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。 用于反转录的引物，可视实验的具体情况，选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的、不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可选择。 【实验目的】 1.了解用逆转录RT-PCR法获取目的基因的原理。 2. 学习和掌握逆转录 PCR 的技术和方法。 【实验原理】 聚合酶链式反应PCR过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA 序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。 一般经过25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。逆转录RT-PCR把以RNA为模板的cDNA合成（即 RNA的反转录）与cDNA 的 PCR 结合在一起，提供了一种基因表达检测、定量和 cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于 cDNA 包括了编码蛋白的完整序列，而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。 首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成cDNA，即总 RNA中的 mRNA 在体外被反向转录合成 DNA 拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）；然后再利用DNA聚合酶，以 cDNA**链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸dNTP为材料，在引物的引导下复制出大量的 cDNA 或目的片段。 在逆转录RT时，有3种引物可选择（表1) 。
表1 用1)和2)方法，理论上是扩增的所有的 cDNA, 还要用此产物做PCR的模板继续扩增。 如果用3)方法，先要去NCBI网站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov查它的序列，并用 oligo等软件设计引物。 逆转录RT-PCR 可以用一步法或两步法的形式进行。两步法 RT-PCR 比较常见, 在使用一个样品检测或克隆多个基因的 mRNA 时比较有用。在两步法RT-PCR中, 每一步都在**条件下进行。 cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行 PCR。 而一步法RT-PCR 具有其它优点(表2), cDNA 合成和扩增反应在同一管中进行, 不需要打开管盖和转移, 有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度, 最低可以达到0.1pg 总RNA, 因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR, 一般使用基因特异性引物(GSP)起始 cDNA 的合成。
表2
图1 由图1可以看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的、部分长的cDNA。 这种方法经常用于获取5'末端序列、及从带有二级结构区域、或从带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得 cDNA。 为了获得最长的 cDNA，需要按经验确定每个 RNA样品中引物与 RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng/每20μl 反应体系。 因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA 主要是核糖体RNA，所以模板一般选用Poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞 mRNA 3'端所发现的 poly(A)尾杂交。因为 poly(A)+RNA大概占总RNA的1%~2%。 所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。 建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性**的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或 oligo(dT)那样同所有RNA退火。 用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP 可以同与mRNA 3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。 已经制备好的双链cDNA和一般的DNA一样，可以插入到质粒或噬菌体中。为此，首先必需有适当的接头(Linker)。接头可以是在 PCR引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经PCR扩增后，再克隆入相应的载体，也可以利用末端转移酶，在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC 或 dT和dA 尾巴, 退火后形成重组质粒, 并转化到宿主菌中，进行扩增。 本实验是要从小鼠肝脏组织中获取 Fas配体基因。Fas配体(FasL)是一分子量约为40u的II型跨膜糖蛋白，属TNF家族成员。活化的T细胞可表达Fas和FasL，并通过Fas/FasL系统介导细胞凋亡作用，保持机体免疫系统的自稳态。 近年研究发现，在部分癌细胞中，FasL表达增强，并与肿瘤的复发转移有关。我们采用逆转录RT-PCR方法克隆FasL全长cDNA，并构建其表达载体。这样可以为进一步研究 FasL的功能提供条件。在上下游引物的5'端分别加上了限制酶切位点、及其保护碱基(即 Hind III 和 BamH I)，以便可以通过双酶切、将目的片段定向克隆到原核表达载体 pGFPUv上（图2）。 为了便于后续实验，可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋白，我们改造了pGFPUv，在其上加了6×His 标签。
图2. pGFPUv质粒载体结构图 【试剂与器材】 一、试剂 1. 总RNA，或 mRNA 2. RNA酶抑制蛋白RNase Inhibitor：40 U/mL 3. dNTP混合物，各10mM 4. oligo(dT)12-18：2.5mol/L 5. 10*逆转录合成缓冲液(10 RT buffer): 250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3)，375 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2 6. AMV 逆转录酶： 5u/L 7. 基因特异性5'和3'引物各20mol/L 8. Magigen Taq DNA 聚合酶 5u/L 9. 10*PCR 缓冲液:500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris-Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0% Triton X-100, 15mmol/L MgCl2。 二、器材 1. PCR仪 2. PCR管 3. 微量移液器 【操作方法】 一、逆转录 1)逆转录RT反应体系构成：
2)涡旋混匀，42℃反应1小时，95℃加热5分钟，然后置于冰上。 二、PCR扩增 1) PCR反应体系构成
2)将上述反应体系涡旋混匀, 按下列程序运行循环
Step2-4运行30个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。 三、取10-20uL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，余下的 PCR产物在-20℃保存。 【RT-PCR注意事项与提示】1. 逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA降解。 2. 成功的逆转录反应决定于高质量的模板RNA。高质量RNA至少应保证全长，并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。 此外，RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是：RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组 DNA。 因此在进行PCR反应时，应该对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照反应，以确定扩增出来的片段是来自基因组 DNA，还是 cDNA。 在无逆转录时，所得到的PCR产物来源于基因组。 3. RT-PCR的起始模板可是总RNA或mRNA，都可以检测到扩增结果，如图3。另外，分离mRNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。 然而，当分析稀有基因时，使用mRNA会增加检测的灵敏度。 4. 在逆转录反应中经常加入RNA酶抑制蛋白，以增加cDNA合成的长度和产量。RNA酶抑制蛋白要在**链合成反应中，在缓冲液和还原剂，如DTT，存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的、可以降解RNA的RNase。RNA 酶抑制蛋白仅防止 RNase A, B, C 对RNA的降解, 并不能防止皮肤上的RNase。 因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心试验者的手上Rnase对样品的污染。 5. 较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将 RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。 然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增，可以使用经过改良的耐高温逆转录酶，如Invitrogen 公司的ThermoScript逆转录酶，使逆转录反应置于较高温度下进行，以改善扩增。 而且适当提高逆转录保温温度, 可增加 RT-PCR的特异性。 6. 建立反应体系时，加完其它反应物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶，然后将全部反应物涡旋混匀。上PCR仪前，加矿物油封盖或设热盖。 7. PCR 反应的循环数一般25-30次就足够了。过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的浪费。 复性温度计算公式： 一般是在引物的Tm值上下浮动。 Tm =2 (A+T) + 4 (G+C) 。 适当提高复性温度可提高 PCR 扩增的特异性。 8. 不管是反转录反应、还是PCR反应，都应先调制试剂的Master Mix (包括 RNase Free dH2O、缓冲液、dNTP Mixture 等)，然后分装到每个反应管中。 这样可使所取的试剂的体积更准确，减少试剂的损失，避免重复分取同一试剂，同时也可以减少实验操作造成的误差。而且，分装试剂时务必用新Tip，以防止样品间的污染。 9. AMV、RNase Inhibitor、Taq酶等酶类，要轻轻地混匀，避免起泡。分取之前要轻轻地离心，收集到反应管底部。因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶类务必在实验前，从-20℃取出，使用后立即放回-20℃保存。 10. **的PCR条件因PCR扩增仪的不同而不同。所以在使用样品之前，**先做Control 反应，以确定**的 PCR条件。为延长 PCR仪的使用寿命，应尽可能缩短PCR仪4℃保存的时间，尽量避免4℃过夜的情况。
图3 逆转录RT-PCR实验结果 Lane 1：总RNA的RT-PCR产物，人细胞调亡因子TF15基因 Lane 2： mRNA 的 RT-PCR 产物，人细胞调亡因子 TF15基因 Lane 3： 100bpmarker 【实验安排】 1. **天：试剂的配制、所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase 处理， 0.1%DEPC浸泡或高温干烤。 2. 第二天：进行(一)逆转录和(二)PCR 扩增。 3. 第三天：进行(三)琼脂糖凝胶电泳检测。 4. 为了保证实验质量, **能将总RNA提取、mRNA的分离纯化、RT-PCR和cDNA文库构建实验这些安排在连续的时间内进行。 【实验报告要求与思考题】 1. RT-PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果; 2. 如何提高逆转录RT-PCR 的灵敏度和特异性? 相关阅读 由LINE-1编码的逆转录酶在癌症发生、发展和治疗中的作用 |
