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用CRISPR Cas13a编辑RNA

作者：Julia

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在生物学中，RNA具有非常重要的作用，但操纵和测量它的分子工具是有限的。例如，RNA干扰可以有效地敲低RNA，但它易于产生脱靶效应，并且可视化RNA通常依赖于外源标签的引入。

如何用CRISPR Cas13a编辑RNA?

在这里，美格君推荐一篇大牛张锋团队的2017年的文章，看看张锋同志的方法对大家有没有启发。

张锋的原文是：RNA targeting with CRISPR Cas13a，详情可以查阅原文。

文章摘要

我们（张锋团队）证明了2类VI型、由RNA引导的RNA靶向CRISPR-Cas蛋白的效应子CRISPR Cas13a蛋白（以前称为C2c2）可以被设计用于哺乳动物细胞RNA敲低和结合。

在初步筛选15个直向同源物后，我们鉴定了来自Leptotrichia wadei（LwaCas13a）的Cas13a蛋白，在大肠杆菌中的干扰测定中最有效。

CRISPR LwaCas13a蛋白可以在哺乳动物和植物细胞中异源表达，用于靶向敲低报告基因或内源转录物，具有与RNA干扰相当的敲低水平和改善的特异性。

催化失活的LwaCas13a，维持靶向RNA结合活性，我们利用它来可编程跟踪活细胞中的转录物。结果表明，CRISPR–Cas13a蛋白是研究哺乳动物细胞中RNA和治疗发展的一个灵活平台。

为了实现稳健的CRISPR Cas13a蛋白介导的RNA敲低，我们首先使用先前描述的氨苄青霉素抗性测定（图1a）评估了15个Cas13a直向同源物的原型间隔区侧翼位点（PFS）偏好和活性。该测定监测Cas13a介导的β-内酰胺酶（氨苄青霉素抗性）转录物的切割，导致氨苄青霉素选择下的细菌死亡，其可以通过定量存活的菌落来测量。使用这种方法，我们发现，来自L.wadei（LwaCas13a）的Cas13a直向同源物最活跃，其次是先前表征的LshCas13a蛋白（来自Leptotrichia shahii）（图1b）。

对来自LwaCas13a和LshCas13a筛选的测序的PFS分布的分析显示，大多数LwaCas13a PFS序列被耗尽。在不同阈值下耗尽的PFS序列的Motif基序分析揭示了LshCas13a的预期3'H基序，但LwaCas13a没有显着的PFS基序（图1c）。该观察结果与先前的研究一致，其显示LwaCas13a比LshCas13a作为核酸传感器更具活性。由于其高活性和细菌中缺乏PFS，我们专注于LwaCas13a蛋白的进一步开发。

与CRISPR LwaCas13a蛋白的体外切割反应证明，可编程RNA使用编码28个核苷酸（nt）间隔区的CRISPR RNA（crRNA）进行切割，短于天然L.wadei CRISPR阵列中发现的29-30nt长度。

图1.

这些反应证实了CRISPR LwaCas13a比LshCas13a有更高的切割效率，并揭示了两种酶的相似生化特征，包括切割相应的pre-crRNA转录物。我们还通过截短间隔区，探索了对LwaCas13a切割的crRNA限制，发现间隔区长度短至20nt，LwaCas13a蛋白也保留了体外切割活性。尽管小于20 nt的引导长度不再支持催化活性，但LwaCas13-crRNA复合物仍可保留结合活性，为单一酶的正交应用提供了机会。

我们接下来评估了CRISPR LwaCas13a切割哺乳动物细胞中转录物的能力。我们将哺乳动物密码子优化的LwaCas13a蛋白克隆到哺乳动物表达载体中，在C或N末端具有msfGFP融合体，并且具有双侧翼核输出序列或核定位序列（NLS），并评估表达和定位（图1d）。我们发现msfGFP融合的LwaCas13a构建体表达良好，并根据定位序列有效定位于细胞质或细胞核。为了评估LwaCas13a的体内切割活性，我们开发了双荧光素酶报告系统，其在同一载体上的不同启动子下，表达Gaussia荧光素酶（Gluc）和Cypridinia荧光素酶（Cluc），允许一个转录物充当LwaCas13a蛋白靶标。另一个用作剂量控制（图1e）。

然后，我们设计了针对Gluc的向导，并将它们克隆到tRNAVal启动子驱动的指导表达载体中。我们将LwaCas13a表达载体，指导载体和双荧光素酶构建体转染到HEK293FT细胞中，并在转染后48小时，测量荧光素酶活性。我们发现LwaCas13a-msfGFP-NLS导致最高水平的敲低（向导1为75.7%，向导2为72.9%），与位置匹配的短发夹shRNA对照相当（向导1为78.3%，向导251.5%）（图1f），这是目标区域的可访问性和序列对照；因此，我们将此设计用于所有进一步的敲低实验。

我们还发现间隔长度为28 nt（73.8%），敲低效率最高，对输入蛋白和指导载体量均有剂量反应，对RNA聚合酶III启动子选择不敏感。

我们接下来测试了三种内源基因KRAS，CXCR4和PPIB在HEK293FT细胞中的敲低。我们观察到不同水平的敲低；对于KRAS和CXCR4，LwaCas13a敲低（PPIB为40.4%，CXCR4为83.9%，KRAS为57.5%）与位置匹配shRNA的RNA干扰（RNAi）相似（PPIB为63.0%），CXCR4为73.9%，KRAS为44.3%）（图1g）。我们还发现用U6或tRNAVal启动子可以敲低KRAS。

在A375黑素瘤细胞系中获得了类似的结果。在所有测试的情况下，通过突变CRISPR/LwaCas13a蛋白的催化结构域来消除敲低。

为了测试CRISPR/Cas13a蛋白敲低在植物中是否有效，我们每个转录物用三个向导靶向三个水稻（Oryza sativa）基因，并且共转染CRISPR LwaCas13a和向导载体到O.sativa原生质体中（图1h）。

转染后，我们观察到9个向导中有7个敲低大于50%的，**敲低率为78.0%（图1i）。

图2.

为了评估CRISPR LwaCas13a敲低的效率范围，我们按照四种转录物的长度：Gluc，Cluc，KRAS和PPIB，平铺向导（图2a）。

Gluc和Cluc平铺筛选显示，向导敲除率大于60%导（图2b，c），大多数Gluc靶向向导显示敲低率大于50%，最高达83%。

为了比较LwaCas13a敲低与RNAi，我们选择了针对Gluc和Cluc的前三个执行向导，并将它们与位置匹配的shRNA进行比较。

我们发现六个表现**的向导中有五个，达到比其对应的shRNA显着更高的敲低水平（P<0.05）。

对于内源基因，我们发现，虽然敲低效率是转录依赖性的，但KRAS和PPIB的**敲低率分别为85%和75%（图2d，e）。

我们从KRAS和PPIB的平铺筛选中选择了前三个向导，观察到CRISPR LwaCas13a的稳健敲低率（53.7-88.8%）相当于shRNA敲低的水平（61.8-95.2%），对于六个向导中的两个，shRNA显着更好（P<0.01），LwaCas13a显著优于六个向导中的两个（P<0.01）（图2f）。

LwaCas13a蛋白还可以介导核转录物MALAT1和XIST的显着敲低，而位置匹配的shRNA显示没有可检测的敲低（P>0.05）（图2g）

LshCas13a活性受大肠杆菌中目标可及性的控制，因此我们使用来自四个平铺筛选的数据，来研究LwaCas13a活性是否高于位于可访问性区域的向导。我们发现最有效的向导比随机预期的更接近，预测的目标可及性可以解释靶向功效的一些变化（敲低变异的4.4-16%）。

由于CRISPR Cas13a蛋白可以处理自己的pre-crRNA，因此它提供了多路复用递送LwaCas13a向导的可能性。

我们针对内源性PPIB，CXCR4，KRAS，TINCR和PCAT转录设计了五种不同的向导，在U6启动子的表达下，用侧翼为36-nt直接重复序列（代表未处理的直接重复序列和截短间隔区）、28-nt引导的CRISPR阵列输送这个靶向系统。

我们发现与单个或组合的向导对照相当的每个基因的敲低水平（图2i）。为了评估这种情况下的特异性，我们测试了针对PPIB，CXCR4和KRAS的三种向导或三种变体的多重递送，其中三种向导中的每一种都被非靶向向导替换。

我们发现，在阵列中没有向导的情况下，只有目标转录被减少（图2j）。

为了进一步研究CRISPR LwaCas13a在体内的特异性，我们将单个错配引入靶向Gluc（图3a）或内源基因（图3b）的向导，也同样测试引入双重错配（图3c）的向导中（图3c）。

我们发现敲低对引导目标双链体中央种子区域的错配敏感，我们还通过生化分析证实了这一点。为了全面探索CRISPR LwaCas13a敲低的脱靶效应，我们进行了全转录组的mRNA测序。我们用CRISPR LwaCas13a蛋白或位置匹配的shRNA构建体靶向Gluc转录物，发现靶转录物的显著敲低（P<0.01）（图3d，e）。

当靶向KRAS和PPIB时，发现相同的结果（P<0.05）。差异表达分析表明，在每种shRNA条件下，有数百个显着的脱靶，但在LwaCas13a条件下没有（图3f），尽管靶转录物的敲低水平相当（shRNA为30.5%，43.5%和64.7%），LwaCas13蛋白分别为62.6%，27.1%和29.2%，分别为Gluc，KRAS和PPIB）（图3g）。

对Gluc靶向RNA-seq比较的进一步分析表明，由于这些脱靶效应，shRNA文库与LwaCas13a蛋白相比，在靶向和非靶向条件之间显示出更高的变异性。

图3.

LshCas13a的附带活性已在体外生物化学实验直接观察到，通过细菌中的生长抑制也间接观察到，但这种活性在哺乳动物细胞中的程度尚不清楚。

多重留一法和RNA测序（RNA-seq）分析表明，缺乏附带RNA降解。我们通过重新分析敲低平铺筛选（图2b-e）验证了这一假设，发现对照基因的表达与靶基因的表达不相关（Gluc:R=0.078，P>0.05；PPIB:R=0.058，P>0.05；KRAS:R=0.51，P<0.001）。

此外，在RNA-seq实验中，除了靶基因之外没有差异表达的基因，表明CRISPR/Cas13a蛋白靶向不会在转录组水平上导致可观察到的细胞应激反应（图3d）。

此外，CRISPR Cas13a蛋白介导的靶向转录物的敲低不影响表达相似水平的CRISPR LwaCas13a的哺乳动物细胞的生长（图3h）。最后，由于哺乳动物细胞中非特异性RNA核酸酶的激活导致RNA大小分布的可检测变化，我们检测了CRISPR LwaCas13a敲低Gluc转录物后细胞中的全局RNA降解，发现靶向和非靶向条件之间的RNA完整性没有差异（P>0.05）。

为了扩展CRISPR LwaCas13a蛋白作为研究RNA的工具的效用，我们通过突变催化精氨酸残基创建了催化死亡变体（dLwaCas13a）。我们使用含有36-nt直接重复序列和28-nt间隔区的向导，用RNA免疫沉淀法（图4a），对被dLwaCas13a蛋白绑定的RNA进行定量。

我们发现，靶向萤光素酶转录物或ACTB mRNA的dLwaCas13a的pulldown（图4b）导致相应靶标相对于非靶向对照的显着富集（萤光素酶富集7.8-11.2倍，ACTB富集2.1-3.3倍；P<0.05），证实dLwaCas13a蛋白是可重编程的RNA结合蛋白。

图4.

dLwaCas13a蛋白的一个应用是作为转录成像平台。为了减少由于未结合的蛋白质引起的背景噪音，我们引入了基于锌指结构自靶向和KRAB结构域抑制的负反馈（NF）系统（图4c）。

与dLwaCas13a相比，当靶向ACTB mRNA时，dLwaCas13a-NF有效地从细胞核转移到细胞质。

为了进一步表征dLwaCas13a-NF的易位，我们用两个向导靶向ACTB转录本，发现与非靶向向导相比，两个向导都增加了易位（3.1-3.7×细胞/核信号比；P<0.001）（图4d，e）。

为了验证dLwaCas13a-NF成像，我们分析了dLwaCas13a-NF信号与ACTB mRNA荧光原位杂交（FISH）信号（扩展数据图10a）的相关性，发现靶向指导与非靶向指导条件存在显着相关性和信号重叠（向导1和2分别为R=0.27和0.30，对于非靶向引导条件，R=0.00；P<0.0001）。

使用dLwaCas13a-NF，我们通过将转录本成像与应力颗粒标记G3BP1的可视化相结合，研究了mRNA在应力颗粒中的积累。

在固定样本中，我们发现ACTB靶向向导的dLwaCas13a-NF荧光与G3BP1水平显着相关（向导1和向导2分别为R=0.49和0.50，非靶向向导为R=0.08；P<0.001）（图4f，g）。

我们接下来在活细胞中进行了应激颗粒追踪，发现，随着时间的推移，每个细胞中，相对应于非靶向对照，靶向ACTB的dLwaCas13a-NF定位于显着更多的应激颗粒（P<0.05）。

这些结果表明CRISPR Cas13a蛋白可以用向导RNA重编程以有效敲低或结合哺乳动物细胞中的转录物。

CRISPR LwaCas13a敲低与RNAi敲低效率相当，但脱靶显着减少，使其可能非常适合治疗应用。此外，它可以介导核RNA和多重敲低。

我们调整用于实时成像转录本追踪的无催化活性的dLwaCas13a可用作可编程RNA结合蛋白。

我们预计LwaCas13a蛋白和dLwaCas13a蛋白将有其他应用，如全基因组合敲低筛选，lncRNA和新生转录功能的询问，用于研究RNA-蛋白质相互作用的下拉分析，翻译调节和RNA碱基编辑。

重要的是，我们没有观察到CRISPR LwaCas13a在哺乳动物细胞中的附带活动的任何证据。

我们的数据显示CRISPR LwaCas13a在哺乳动物和植物细胞中具有广泛功效和高特异性的功能，为一系列转录组分析工具和治疗方法提供平台。

方法材料

没有统计方法用于预先确定样本量。实验不是随机的。在实验和结果评估期间，研究人员并不是盲配。

用于活性筛选和重组表达的直向同源物的克隆

我们合成了15个CRISPR Cas13a直向同源物（Genscript）的人密码子优化版本，并将它们克隆到pLac启动子下的pACYC184中。与CRISPR Cas13a表达盒相邻，我们克隆了直向同源物相应的直接重复序列，侧翼为β-内酰胺酶靶向或非靶向间隔区。间隔区阵列表达由J23119启动子驱动。也可以购买市售的CRISPR Cas13蛋白，如IDT，Magigen CRISPR Cas13a蛋白。

为了纯化LwaCas13a，我们将哺乳动物密码子优化的LwaCas13a序列克隆到细菌表达载体中进行蛋白质纯化（6×His/Twin Strep-SUMO）。

细菌体内测试CRISPR Cas13a活性和PFS鉴定

简而言之，对CRISPR Cas13a蛋白进行编程以靶向侧翼为随机PFS核苷酸的β-内酰胺酶转录物上的5'延伸序列。氨苄青霉素选择下，CRISPR Cas13a切割活性导致细菌死亡，随后通过下一代测序分析PFS消耗。

为了测试CRISPR Cas13a蛋白直向同源物的活性，将90ng具有靶向或非靶向指导的直向同源物表达质粒，与25ng先前描述的β-内酰胺酶靶质粒共转化到NovaBlue Singles Competent Cells （Millipore）中。

转化后，将细胞稀释，铺在补充有100μg/μl-1氨苄青霉素和25μg/μl-1氯霉素的LB琼脂上，并在37℃下孵育过夜。第二天计算转化体。

为了测定LshCas13a和LwaCas13a PFS同一性，每个生物学重复，将40ng具有靶向或非靶向间隔区的直向同源物表达质粒与25ngβ-内酰胺酶靶质粒共转化为两个等份的NovaBlue GigaSingles（Millipore）。进行两次生物学重复。

转化后，每次生物学重复，在37℃下，在500μLSOC（ThermoFisher Scientific）中，将细胞恢复1小时，涂布在补充有100μg/μl-1氨苄青霉素和25μg/μl-1氯霉素的LB琼脂（Affymetrix）的生物测定板（Corning）上，并在37℃温育16小时。

然后通过刮擦收获菌落，并用NuceloBond Xtra EF（Macherey-Nagel）纯化质粒DNA用于随后的测序。

使用NEBNext High Fidelity 2X Master Mix（New England Biosciences），利用条形码引物和Illumina flowcell handles，通过PCR，制备收获的质粒样品，用于下一代测序。

合并PCR产物，并使用Zymoclean凝胶提取试剂盒（Zymo Research）进行凝胶提取，并使用MiSeq下一代测序仪（Illumina）进行测序。

PFS的计算分析

从LshCas13a和LwaCas13a PFS筛选文库的新一代测序数据中，我们比对随机化PFS区域侧翼的序列，并提取PFS识别。

我们将PFS识别折叠为四个核苷酸，以提高序列覆盖率，计算每个**PFS的频率，并对每个文库的的总读取计数进行标准化，参数pseudocount=1。

如扩展数据Fig 1c中所示，每个分布的富集,针对pACYC184对照（无蛋白质/指导基因座）,计算公式为

-log₂（f_condition/f_pACYC184），其中f_condition是实验条件下PFS识别的频率，f_pACYC184是pACYC184对照中PFS识别的频率。

为了分析一个保守的PFS基序，利用每个条件的非靶向对照计算最高的耗尽的PFS识别，

公式：-log₂（f_{i，targeting}/f_{i，non-targeting}），其中fi，targeting是条件i中PFS识别的频率，带有靶向间隔子和fi，非靶向是条件i中具有非靶向间隔物的PFS识别的频率。

CRISPR LwaCas13a蛋白的纯化

如前所述进行CRISPR LwaCas13a蛋白的纯化。简而言之，将CRISPR LwaCas13a细菌表达载体转化到Rosetta 2(DE3)pLysS singles Competent Cells （Millipore）中，并用起始培养物接种4μlTerrific Broth 4生长培养基。

用4 l Terrific Broth 4生长培养基作为起始培养。

用IPTG诱导细胞蛋白表达，过夜生长后，收获细胞沉淀，并保存在-80°C。细胞裂解后，使用 StrepTactin Sepharose resin （GE）结合蛋白，并通过SUMO protease digestion （ThermoFisher）洗脱蛋白。

使用HiTrap SP HP cation exchange column（GE Healthcare Life Sciences），通过阳离子交换，随后使用Superdex 200 Increase 10/300 GL column（GE Healthcare Life Sciences），通过凝胶过滤，进一步纯化蛋白质，两步均通过FPLC（AKTA PURE，GE Healthcare Life Sciences）。

合并含有CRISPR LwaCas13a蛋白的最终组分，并浓缩到储存缓冲液（600mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 7.5,5%甘油，2mM DTT）中，并将等分试样，在-80℃冷冻，以长期储存。

哺乳动物和植物表达构建体的克隆

合成人密码子优化的CRISPR Cas13a基因（Genscript）并克隆到具有核输出序列或在EF1-a启动子表达下的NLS的哺乳动物表达载体中。由于单体超折叠GFP（msfGFP）赋予的稳定性，我们将msfGFP融合到LwaCas13a蛋白的C末端。

通过在两个HEPN结构域中引入R474A和R1046A突变，产生了无催化活性的LwaCas13a–msfGFP构建体（死的LwaCas13a或dLwaCas13a）。

要生产药物筛选版本的LwaCas13a–msfGFP，需要将蛋白克隆到骨架中，该骨架具有杀稻瘟素筛选标记，通过2A肽序列与C末端连接。

dLwaCas13a-msfGFP构建体（dLwaCas13a-NF）的负反馈版本是通过克隆dLwaCas13a-msfGFP启动子上游的锌指结合位点，并将锌指和KRAB结构域融合到C末端而产生的。

通过在单个载体上克隆在CMV启动子表达下的Cypridinia荧光素酶Cluc和在EF1-a启动子表达下的Gaussia荧光素酶Gluc来产生报道荧光素酶构建体。

两种荧光素酶在单个载体上的表达允许一种荧光素酶用作剂量对照，标准化另一种荧光素酶敲低，控制由于转染条件引起的变异。

对于图1g中的内源性敲低实验，使用RNAxs siRNA设计算法20来设计向导和shRNA。预测工具用于设计shRNA，并且向导设计在相同位置，以允许shRNA和CRISPR LwaCas13a敲低之间的比较。

对于植物敲低实验，用PCR从pANIC6A扩增水稻肌动蛋白启动子pOsActin，用PCR从人表达LwaCas13a蛋白构建体扩增LwaCas13a。

将这些片段连接到现有的植物表达质粒中，使得CRISPR LwaCas13a蛋白由水稻肌动蛋白启动子驱动，并且转录由HSP终止子终止，而LwaCas13a gRNA由水稻U6启动子pOsU6表达。

原生质体制备

如前所述制备绿稻原生质体 (O. sativa L. ssp. japonica var. Nipponbare) ，稍作修改。

幼苗生长14天，原生质体重悬于含有0.1M CaCl₂的mMG缓冲液中。该修饰的mMG缓冲液用于制备新鲜的40%PEG缓冲液以及代替WI缓冲液。最后，将原生质体在转化后完全黑暗中保持48小时。所有其他条件如前所述。

制备用于体外反应和附带活性测定的核酸靶标和crRNA

为了产生核酸靶标，用KAPA Hifi Hot Start（KAPA Biosystems）试剂，PCR扩增寡核苷酸。

使用MinElute凝胶提取试剂盒（Qiagen）对dsDNA扩增子进行凝胶提取和纯化。

所得纯化的dsDNA，在30℃下，用HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit（New England Biolabs）试剂，过夜孵育，被转录。

使用MEGAclear Transcription Clean-up kit (Thermo Fisher)试剂纯化转录的RNA。

为了制作crRNA，订购寡核苷酸，这是具有额外5'T7启动子序列的DNA（Integrated DNA Technologies）。

用T7引物（最后浓度10μM）退火crRNA模板DNA，并通过在37℃下，用HiScribe T7 Quick High Yield RNA合成试剂盒（New England Biolabs）孵育过夜，转录。

用RNAXP clean beads（Beckman Coulter）纯化得到的转录的crRNA，使用2倍比例的珠子与反应体积，补充额外的1.8倍比例的异丙醇isopropanol（Sigma）。

LwaCas13a蛋白切割和附带活性检测

对于CRISPR LwaCas13a蛋白的生物化学表征，如前所述进行测定。简言之，除非另有说明，否则用160nM末端标记的单链（ss）RNA靶标，200nM纯化的LwaCas13a蛋白和100nM crRNA进行核酸酶测定。

所有测定均在核酸酶测定缓冲液中进行，40mM Tris-HCl，60 mM NaCl，6 MgCl 2，pH 7.3。

对于阵列处理，每个核酸酶测定使用100ng的体外转录阵列。

使反应在37℃下进行1小时（除非另有说明），然后用蛋白酶缓冲液（150U ml-1蛋白酶K，60mM EDTA和4M尿素urea）在37℃下淬灭15分钟。

然后将反应物用4.5M尿素变性缓冲液在95℃变性5分钟。

在45℃下，用10% PAGE TBE-Urea (Invitrogen) ，通过变性凝胶电泳，分析样品。

使用Odyssey扫描仪（LI-COR Biosciences）对凝胶成像。

进行CRISPR Cas13蛋白附带活性检测测定

简而言之，反应构成：45nM纯化的LwaCas13a，22.5nM crRNA，125nM猝灭荧光RNA报道分子（RNase Alert v2，Thermo Scientific），

2μl小鼠RNase抑制剂（New England Biolabs），100ng全人RNA（从HEK293FT培养物中纯化），和不同量的输入核酸靶标，

除非另有说明，反应在核酸酶测定缓冲液（40mM Tris-HCl，60mM NaCl，6mM MgCl 2，pH 7.3）中。

在37℃（除非另有说明），使反应在荧光板读数器（BioTek）上进行1-3小时，每5分钟测量荧光动力。

平铺向导筛选克隆

对于平铺向导筛选，间隔物被设计成以均匀间隔，靶向mRNA转录物，以完全覆盖转录物的整个长度。

将间隔区spacer（从IDT订购）退火并将golden-gate 克隆到具有tRNAval启动子（Gluc和Cluc筛选）或U6启动子（所有内源筛选）的LwaCas13蛋白指导表达构建体中。

用CRISPR Cas13a蛋白敲低的哺乳动物细胞培养和转染

除非另有说明，否则所有哺乳动物细胞实验均在HEK293FT品系（美国典型培养物保藏中心（ATCC））中进行。HEK293FT细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基中培养，该培养基中添加了高葡萄糖，丙酮酸钠和GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific），并补充了10%胎牛血清（VWR Seradigm）和1x青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific）。

传代细胞以保持融合度低于70%。对于涉及A375（ATCC）的实验，将细胞在补充有9%胎牛血清（VWR Seradigm）和1x青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific）的RPMI培养基1640（Thermo Fisher Scientific）中培养。

HEK293FT细胞在从ATCC接收后未经鉴定，未检查支原体污染。

为了检测内源基因的敲低情况，用每孔150ng CRISPR LwaCas13a蛋白质粒和250ng向导质粒，除非另有说明。

测试报告质粒敲低的实验补充了每孔12.5 ng报告子构建。转染前16小时，将细胞以每孔约20000个细胞的量接种在96孔板中，并使其一晚生长至90%融合度。

对于每个孔，将质粒与Opti-MEM I Reduced Serum Medium （Thermo Fisher）合并至总共25 μl，单独的0.5 μl Lipofectamine 2000转染试剂与24.5μl的Opti-MEM结合。

然后将质粒与Lipofectamine溶液混合，培养5 分钟，然后缓慢吸移到细胞上以防止破裂。

绿稻原生质体的转化

对于绿稻实验，将表达每种CRISPR LwaCas13a蛋白质粒和相应的指导RNA以等摩尔比混合，使得总共有30μgDNA，用于每次转化200000个原生质体。

荧光素酶活性的测定

除非另有说明，转染后48小时，收获含有萤光素酶分泌的培养基。将培养基在PBS中以1:5稀释，然后使用BioLux Cypridinia和BioLux Gaussia荧光素酶测定试剂盒（New England Biolabs）在Biotek Synergy 4酶标仪上，以injection protocol，测量荧光素酶活性。所有重复均作为生物学重复进行。

总RNA的收获和定量PCR

对于哺乳动物细胞中的基因表达实验，使用先前提到的商业试剂盒Cells-to-Ct kit （Thermo Fisher Scientific），在转染后48小时，进行细胞收集和逆转录以产生cDNA。

然后使用Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific）和TaqMan qPCR探针（Thermo Fisher Scientific，补充表8和9）和GAPDH对照探针（Thermo Fisher Scientific），用qPCR定量转录物表达。

所有qPCR反应均是5-μl反应，以384孔形式，进行四次技术重复的反应，并使用LightCycler 480 Instrument II（Roche）读数。

对于多重靶向反应，在不同的孔中读出不同的靶标。通过从目标Ct值中减去看家对照（GAPDH）循环阈值（Ct）来计算表达水平，以标准化总输入，从而得出ΔCt水平。

相对转录丰度计算为：2−ΔCt。所有重复均作为生物学重复进行。

对于植物细胞中的基因表达实验，根据制造商的方案，使用Trizol孵育48小时后,分离总RNA。

根据制造商的协议，将1纳克总RNA用于SuperScript III Plantinum SYBR Green一步qRT-PCR试剂盒（Invitrogen）。

所有样品在LightCycler 480仪器（Roche）上，以384孔格式，做3次三个生物学重复。所有PCR引物在熔解曲线分析的基础上被证实是特异性的，并且如下：

OsEPSP（Os06g04280），5'-TTGCCATGACCCTTGCCGTTGTTG-3'和5'-TGATGATGCAGTAGTCAGGACCTT-3'；

OsHCT（Os11g07960），5'-CAAGTTTGTGTACCCGAGGATTTG-3'和5'-AGCTAGTCCCAATAAATATGCGCT-3'；

OsEF1a（Os03g08020），5'-CTGTAGTCGTTGGCTGTGGT-3'和5'-CAGCGTTCCCCAAGAAGAGT-3'。

先前已经描述了OsEF1a的引物。

为了分析用CRISPR LwaCas13a敲低后的RNA质量，通过使用TRI试剂裂解细胞并使用Direct-zol RNA MiniPrep Plus试剂盒（Zymo）纯化RNA来收获总RNA。使用RNA 6000 Pico Bioanalyzer试剂盒（Agilent）分析4纳克总RNA。

目标可达性的计算分析

为了首先分析目标可达到性，分析了平铺筛选上的顶部向导，以确定它们是否比预期的更组合紧密，假设如果存在可访问区域，则该区域中的多个向导将预计望高度活跃。

顶部向导被定义为Gluc平铺筛选执行向导的前20%，Cluc，KRAS和PPIB平铺筛选执行向导的前30%。

通过随机模拟10000个引导位置，然后与实验确定的顶部引导成对距离进行比较，为引导之间的成对距离生成零概率分布。

使用 Vienna RNA软件中的RNApl折叠算法预测了可达性。使用70 nt大小的默认窗口，并将未配对目标区域的概率计算为整个目标区域中28个单核苷酸未配对概率的平均值。

将这些可访问性曲线平滑，并与四个转录本中每个转录本的平滑敲低曲线进行比较，并使用Pearson相关系数与SciPy Python软件包（pearsonr函数）计算两个因素之间的相关性及其显着性。

通过对两个变量执行二维核密度估计，还可以看到这两个因素的概率空间。

RNA测序和分析

为了分析CRISPR LwaCas13a蛋白敲低的特异性，对来自涉及LwaCas13a和shRNA构建体的敲低实验的mRNA进行RNA-seq测序。

使用Qiagen RNeasy Plus Mini kit48小时后，从转染实验中制备总RNA。然后使用NEBNext Poly（A）mRNA磁分离模块提取mRNA，并使用用于Illumina的NEBNext超定向RNA文库制备试剂盒制备RNA-seq文库。

RNA-seq文库在Illumina NextSeq仪器上测序，每个文库至少有1000万个读数。

使用RefSeq GRCh38程序集生成索引，并使用Bowtie和RSEM1.2.31版本,默认参数, 对读数进行比对和定量。

每百万转录本（TPM）值用于表达计数，并通过取log2（TPM++1）转换为对数空间。

为了找到差异表达的基因，对三个靶向重复与三个非靶向重复进行了学生t检验。

在六次重复中至少两次, 对log2（TPM+1）值大于2.5的基因进行统计分析。只有差异表达大于2或小于0.75, 且错误发现率<0.10的基因,才显着差异表达。

使用Kendall的tau系数进行重复和重复平均之间的互相关。通过考虑六个重复（三个靶向和三个非靶向重复）中基因表达的标准偏差的分布，来分析shRNA与LwaCas13a文库的变化，并表示为小提琴图。

细胞活力测定

用荧光素酶报告基因靶标，向导质粒和CRISPR LwaCas13a蛋白或药物筛选的CRISPR LwaCas13a来转染哺乳动物细胞。

转染后24小时，将细胞以1:5分成新鲜培养基，药物筛选的CRISPR LwaCas13a蛋白样品补充10μg ml-1Blasticidin S (Thermo Fisher Scientific)。

在额外48小时的生长后，测定细胞的荧光素酶敲低，通过多模板读数器（Biotek Neo2）上的GFP荧光测量维持LwaCas13a表达，以及通过 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（Promega）测定的细胞生长。

定量dLwaCas13a蛋白与RNA免疫沉淀

对于RNA免疫沉淀实验，将HEK293FT细胞铺在六孔板中，并用1.3μg dlwaCas13a蛋白表达质粒和1.7μg向导质粒转染，在涉及报告者靶向的情况下，另外用150ng报告质粒。

转染后48小时，将细胞用冰冷的PBS（Sigma）洗涤两次，并在室温下，在PBS中，用0.2%多聚甲醛paraformaldehyde （Electron Microscopy Sciences）固定15分钟。

固定后，除去多聚甲醛，加入125mM甘氨酸的PBS溶液以淬灭交联，将细胞温育10分钟。用冰冷的PBS洗涤细胞两次，刮取收集细胞，并将细胞悬浮液以800g，离心4分钟，以沉淀细胞。

除去上清液，裂解前用PBS洗涤颗粒。用200μl补充有cOmplete ULTRA Tablets， EDTA-free （Sigma）和核糖核酸酶抑制剂（Sigma R1158）的1×RIPA缓冲液（Cell Signaling）裂解细胞。

使细胞在冰上裂解10分钟，然后在Bioruptor超声仪（Diagenode）上，以低强度，30秒开/30秒关的循环，进行2分钟超声处理。

通过在4°C下以16000g离心10分钟颗粒化不溶物，并将含有澄清裂解物的上清液用于磁珠 pulldown 。

为了将抗体与磁珠缀合，通过使用磁体，使每个用于免疫沉淀的Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation (Thermo Fisher Scientific) 100μl样品被颗粒化，并除去上清液。

将珠粒重悬于200μl洗涤缓冲液（PBS补充有0.02%Tween 20 (Sigma））中，并加入5μg rabbit anti-Mouse IgG （Sigma M7023）。

在室温下，将样品放在旋转器上，孵化10分钟，以使抗体与珠子缀合。孵化后，用磁铁将珠子颗粒化，除去上清液，并用洗涤缓冲液洗涤珠子两次。

将颗粒重悬于100μl洗涤缓冲液中，并分成两个50μl体积，用于缀合anti-HA antibody （Thermo Fisher Scientific 26183）或IgG抗体对照（Sigma I5381）。

对于每种抗体，向2.5μg抗体中加入200μl洗涤缓冲液，并在室温下，在旋转器上温育10分钟。温育后，使用磁铁颗粒化珠子，并用洗涤缓冲液洗涤两次，并重悬于含有核糖核酸酶抑制剂（Sigma R1158）和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma P8340）的200μl 1×RIPA中。将100微升样品裂解物加入珠子中，并在4℃下旋转过夜。

与样品裂解物一起温育后，颗粒化珠子，用1×RIPA，0.02%Tween 20，洗涤三次，然后用DNase缓冲液（350mM Tris-HCl（pH 6.5）；50mM MgCl 2；5mM DTT）洗涤。

将珠粒重悬于DNase缓冲液中，并加入TURBO DNase（Life Technologies）至终浓度为0.08单位/微升。在37℃下，将DNase在旋转器上温育30分钟。

然后通过加入蛋白酶K（New England Biosciences）将蛋白质消化至终浓度为0.1单位/微升，并在37℃下旋转，再孵育30分钟。

为了变性和纯化，加入尿素（Sigma）至终浓度为2.5M，样品孵育30min，使用Direct-Zol RNA miniprep（Zymo Research）纯化RNA。

使用qScript Flex cDNA（Quantabio）将纯化的RNA逆转录成cDNA，并使用Fast Advanced Master Mix和TaqMan qPCR探针（补充表8和9），用qPCR定量pulldown。

所有qPCR反应均以5-μl反应进行，并以384孔格式进行4次技术重复，并使用LightCycler 480 Instrument II进行读数。与其匹配的IgG抗体对照相比，对样品进行富集定量。

CRISPR LwaCas13a蛋白和LwaCas13a NF的易位测量

将HEK293FT细胞接种在聚-d-赖氨酸盖玻片（Corning）上的24孔组织培养板中，并用150ng dLwaCas13a-NF载体和用于ACTB成像的300ng向导转染。对于易位实验，将细胞用4%PFA固定，48小时后用0.2%Triton X-100透化，并使用带有DAPI的抗褪色固定介质（Vectashield）固定。共聚焦显微镜使用的是带有Andor Yokagawa Spinning disk Revolution WD系统的Nikon Eclipse Ti1。

通过测量平均细胞质和核msfGFP荧光，并比较靶向和非靶向条件之间细胞的比率，来分析具有靶向ACTB mRNA向导的dLwaCas13a-NF的核输出。

ACTB转录的FISH

将HEK293FT细胞接种在聚-d-赖氨酸盖玻片（Corning）上的24孔组织培养板中，并用75ng dLwaCas13a-NF载体和用于ACTB成像的250ng向导转染。48小时后，将细胞用4%PFA固定45分钟。使用QuantiGene viewRNA ISH细胞测定试剂盒（Affymetrix）根据生产商的方案在细胞样品上进行FISH。完成FISH程序后，使用防褪色固定介质（Vectashield）固定盖玻片。使用具有Andor Yokagawa Spinning disk Revolution WD系统的Nikon Eclipse Ti1进行共聚焦显微镜检查。

CRISPR LwaCas13a蛋白对应力颗粒的跟踪

将HEK293FT细胞铺在聚-d-赖氨酸盖玻片（Corning）上的24孔组织培养板中，并用75ng dLwaCas13a-NF载体和用于ACTB成像的250ng向导物进行转染。对于应力颗粒实验，在固定和透化细胞之前，使用200μM亚砷酸钠1小时。对于G3BP1的免疫荧光，将细胞用20%山羊血清封闭，并在室温下与anti-G3BP1 primary antibody（Abnova H00010146-B01P）孵育过夜。然后将细胞与用Alexa Fluor 594标记的二抗孵育1小时，并使用具有DAPI（Vectashield）的抗褪色封固剂封固。使用具有Andor Yokagawa Spinning disk Revolution WD系统的Nikon Eclipse Ti1进行共聚焦显微镜检查。

使用Pearson相关系数，使用每个细胞的平均msfGFP和G3BP1信号，计算与dLwaCas13a–NF的应激颗粒共定位。使用Coloc 2插件在图像分析软件FIJI中进行共定位分析。

对于实时成像实验，将HEK293FT细胞铺在96孔组织培养板中，并用150ng dLwaCas13a-NF载体，用于ACTB成像的300ng向导物和5ng G3BP1-RFP报告基因进行转染。48小时后，将细胞置于0μM或400μM亚砷酸钠中，在Opera Phenix高内涵筛选系统（PerkinElmer）上，使用具有20倍水物镜的旋转盘共聚焦设置，每15分钟成像一次，共2小时。将细胞在含有50%CO₂的潮湿室中保持在37℃。使用Opera Phenix Harmony软件（PerkinElmer）测量了活细胞dLwaCas13a–NF与G3BP1–RFP在应激颗粒中的共定位。

Note:

什么是shRNA？

shRNA是英文单词short hairpin RNA的缩写。翻译为“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向重复序列。克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。