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如何找到**的PCR反应体系?PCR技术所需要的酶和原料的调整

作者:反应体系

PCR技术

PCR反应体系设计

PCR反应涉及多种原料成分。PCR原料成分的多少、分配比例会影响PCR反应的效果。

对PCR各种原料进行科学的比例分配是一个需要不断摸索、改进的过程。

通过不断的测试探索,才可能找到**的反应体系。


PCR原料的控制

1. PCR引物量

每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。


2. PCR引物浓度

引物的浓度会影响特异性。**的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。


3. 引物退火温度

引物的另一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。


设定Tm有几种公式,根据所使用的公式及引物序列的不同,Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值,所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm-5℃,以2℃为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得**结果,两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。


4. 引物纯度和稳定性

定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。因脱盐而除去的苯甲酰基和异丁酰基很少,因此不会干扰PCR。部分应用需要纯化,以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100%。这是个循环过程,在每个碱基加入时使用重复化学反应,使DNA从3'到5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物,尤其是大于50个碱基,截断序列的比例很大,可能需要纯化。


引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。擎科、生工等生物公司,均以一个最小OD单位确保总寡核苷的产量。定制引物以干粉形式运输。**在TE重溶引物,使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好,因为水的pH经常偏酸,会引起寡核苷的水解。


引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月,但在室温(15℃到30℃)仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室温(15℃到30℃)最多可以保存2个月。


5. 酶及其浓度

目前使用的Taq DNA聚合酶,基本上都是大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。不同公司的Taq酶效果也有不同,而且要搭配相应的体系才能发挥其效用,例如Magigen Taq聚合酶就要搭配Magigen的体系。


6. dNTP的质量与浓度

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris.HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。


7.   Mg2+浓度

PCR反应体系中Mg2+的作用

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。


镁离子影响PCR的多个方面,如DNA聚合酶的活性,这会影响产量;再如引物退火,这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合,降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。**的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同,但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM(注意:对实时定量PCR,使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液)。较高的游离镁离子浓度可以增加产量,但也会增加非特异性扩增,降低忠实性。为了确定**浓度,从1mM到3mM,以0.5mM递增,进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖,可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能够在比Taq DNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能,因此仅需较少的优化.




8. 模板(靶基因)核酸

模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。


9. 促进PCR的添加剂

退火温度,引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增,但是,某些模板,包括高GC含量的模板,需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得**的结果需要模板的完全变性。

另外,二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。

PCR添加剂,包括甲酰胺,DMSO,甘油,甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度,从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution还有其他优点。在同Platinum Taq DNA聚合酶和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用时,仅需很少的镁离子优化。这样,将Platinum技术同添加剂结合,增强了特异性,同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得**结果,应优化添加剂的浓度,尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO,甲酰胺和甘油。


10. 热启动

热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的**延伸温度在72℃,聚合酶在室温会仍然有活性。因此,在进行PCR反应配制过程中,以及在热循环刚开始,保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成,就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时,如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作,热启动PCR尤为有效。

如何限制Taq DNA聚合酶活性?

限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液,并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜,但并不能完成抑制酶的活性,因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。


热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐,尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分,入镁离子或酶,包裹起来,或者将反应成分,如模板和缓冲液,物理地隔离开。在热循环时,因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。手动热启动方法一样,蜡防护层法比较烦琐,易于污染,不适用于于高通量应用。


Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。抗体在PCR配制,以至于在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在变性步骤的94℃保温过程中被释放到反应中,恢复了完全的聚合酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比,Platinum酶不需要在94℃延时保温(10到15分钟)以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶,在94℃进行2分钟就可以恢复90%的Taq DNA聚合酶活性。


11. 递减PCR

递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环开在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1℃到2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增,并会将扩增的非特异性产物排挤出去。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用,如AFLP DNA指纹分析。


12. 巢式PCR

使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。**轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。或者,也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物,其可以同**套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性,因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环(30到40)会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的灵敏度,并且提高了困难PCR(如5' RACE)的特异性。


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