恒温扩增技术系列之环介导LAMP扩增技术

作者：Magigen

美格生物最近推出的恒温扩增技术产品LAMP试剂盒 2×LAMP Amplification Mix ‍ ‍‍是全新一代LAMP扩增技术产品。

什么是LAMP扩增技术？

LAMP恒温扩增技术的英文名称是:Loop-mediated isothermal amplification, LAMP, 中文名称是：环介导等温扩增反应。

LAMP技术的历史

LAMP技术是日本学者Notomi在2000年发明的，他利用特殊的引物设计方法和恒温核酸链置换酶，可以在60分钟内，将少量目标DNA 扩增到千百万份。目前该技术应用已经有超过20年的历史。

等温扩增LAMP技术扩增原理图

图1. LAMP扩增反应原理图

环介导等温核酸扩增反应LAMP扩增原理

LAMP技术是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6-8个区域设计4-6种特异引物，进行高度特异性扩增反应。在链置换酶Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，与特殊设计的引物形成“环”结构，在60~65℃进行恒温扩增，大约15-60分钟就可实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增，具有操作简单。在DNA合成的时候，从脱氧核糖核酸三磷酸底物dNTP中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生了大量的焦磷酸镁沉淀，呈现白色，可以把浑浊度作为反应的指标，只依靠肉眼观察白色浑浊沉淀，就可以鉴定是否有扩增，不需要繁琐的电泳和紫外观察。

LAMP引物设计和反应原理如图1所，在每一套LAMP的引物中，包括两个外部引物：F3和B3，两个内部引物：FIP和BIP，以及两个环导引物：LOOP F和LOOP B。

LAMP反应混合物由dNTPs、引物、DNA模板、链置换聚合酶Bst酶和荧光染料。用于LAMP反应的引物设计比较特别。向前内引物FIP由3' 末端的F2区和5' 末端的F1c区组成；F3引物是正向外引物，由F3区组成，与模板序列的F3c区互补；向后内部引物BIP由3' 末端的B2区域和5' 末端的B1c区域构成。向后外引物-B3引物-由B3区组成，与模板序列的B3c区互补。当FIP的F2区与靶DNA的F2c区杂交，并启动互补链合成时，开始扩增，然后F3引物与靶DNA的F3c区域杂交，并延伸，取代FIP连接的互补链。该置换链在5' 末端形成环LOOP，这种在5' 末端具有环的单链DNA用作BIP的模板，B2与模板DNA的B2c区域杂交，启动DNA合成，形成互补链、并打开5' -末端环，随后，B3与靶DNA的B3c区域杂交并延伸，置换BIP连接的互补链，这导致形成哑铃形DNA。通过Bst DNA聚合酶将核苷酸添加到F1的3' 末端，其在5' 末端延伸并打开环，哑铃形DNA现在转变为茎环结构。该结构用作LAMP循环的引发剂，它是LAMP反应的第二阶段。也可以添加环引物用于LAMP的指数扩增，获得的最终产品是具有不同茎长度的茎环DNA和具有多个环的各种类似于菜花的结构的混合物。

LAMP反应温度一般在65°C，扩增程度小于250nt。DNA产物非常长，大于20KB，由80–250bp的短目标序列多次重复形成，与长链共聚体中的单链环区相连。这些产品通常不适合下游操作，但目标扩增非常的多，因此有可能有多种检测模式。采用插层或探针、横向流动和琼脂糖凝胶检测等方法的实时荧光检测均与LAMP反应直接兼容。LAMP设备通常需要加热到所需反应温度，并在需要时实时荧光进行定量测量。

LAMP扩增产物的检测方法

目前，应用比较广泛的LAMP检测方法主要有以下几种：

横向侧流技术：利用横向侧流试纸条进行检测；
荧光检测：在LAMP反应液中加入 SYBRGreenΙ ，可以在紫外灯下通过肉眼判定；
目测或浊度检测：通过对扩增过程中产生的副产物-焦磷酸镁沉淀-来检测判断有无扩增产物；
凝胶电泳检测：由于扩增后的产物是一系列反向重复的靶序列构成的，是茎环结构和多环花椰菜结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显示不同大小区带的阶梯式图谱。

LAMP技术的优点

特异性高。针对靶序列的6个区域设计4种特异性引物，6个区域中如有一处与引物不匹配，就不能进行核酸扩增。
灵敏度高。对某些病原体进行扩增，模板只要几个拷贝数，与PCR相比高出几个数量级。
高效、快速。不需要预先的双链DNA的热变性，反应时间短，30～60分钟就能完成反应，避免了温度循环造成的时间损失。
操作简单。 LAMP扩增反应只需要一个简单的恒温器，水浴锅、金属浴均可完成此实验，不需要昂贵的仪器，可方便操作。
检测LAMP产物方便。 LAMP 在合成 DNA 的过程中会产生大量的焦磷酸根离子，能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，因此可以根据反应体系中是否生成白色沉淀来判断反应的进行情况。

环介导等温扩增LAMP方法的缺点与局限

容易假阳性。LAMP扩增技术灵敏度高，一旦开盖就容易形成气溶胶污染，目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重。大量研究推荐使用浊度计等不开盖方法检测扩增产物。但这些措施并不能在根本上解决假阳性率高的问题，还会存在非特异性扩增。此类非特异扩增产物的出现与引物序列性质、反应时间的长短有关系，通过引物筛选、反应时间优化能很大程度上降低其产生几率，但这会影响LAMP技术的可靠性，限制其在临床的推广。
LAMP引物设计难度较大。LAMP引物设计要求比较高，对靶序列和引物的长度有很高要求以确保特异性扩增，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增方法；
反应结果只有扩增和不扩增两种，一旦出现非特异性的扩增，则不易鉴别。
很难做多重扩增，两三个靶点可以，再多难度就非常大了。
在敏感性上、定量能力上、封闭系统等方面LAMP反应不如实时PCR。

LAMP扩增反应的实际应用

由于环介导等温扩增技术LAMP扩增技术使用简便、成本低、灵敏度高，该技术目前已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测，以及各种细菌、病毒、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口现场快速诊断中。