诺贝尔奖得主Doudna讲解CRISPR Cas14蛋白切割原理

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微生物和病毒之间的竞争刺激了基于CRISPR的适应性免疫的进化，以提供针对感染因子的防护。

在第2类CRISPR/Cas系统中，具有多个功能结构域、单个大小100至200kDa的CRISPR Cas蛋白携带向导RNA，切割DNA或RNA底物。

为了确定在自然界中是否存在更简单，更小的RNA引导蛋白质，我们查询了海量宏基因组数据集，以查找CRISPR阵列和cas1附近的未表征基因，cas1是编码通用CRISPR整合酶的基因。

该分析鉴定了包含cas1，cas2，cas4和先前未识别的编码40-70kDa多肽的基因cas14的多种CRISPR-Cas系统家族（图1A）。

我们最初在比较序列分析的基础上鉴定了24个不同的CRISPR cas14基因变体，这些变体聚集成三个亚组（Cas14a，Cas14b和Cas14c）（图1，A和B以及图1和图2）。

CRISPR Cas14蛋白约为400至700个氨基酸（aa），约为先前已知的2类CRISPR RNA引导酶（950至1400 aa）大小的一半（图1，C和D）。

尽管鉴定的CRISPR Cas14蛋白表现出相当大的序列多样性，但所有蛋白都通过预测的RuvC核酸酶结构域的存在而结合，所述RuvC核酸酶结构域的组织是V型CRISPR Cas DNA靶向酶的特征（图1D）。

图1 CRISPR Cas14基因组位点的结构和系统发育图

（A） V型CRISPR系统的系统发育树。新确定的微型CRISPR系统以橙色突出显示。

（B） C2c10和CRISPR-Cas14系统的代表性基因座架构。

（C） 与CRISPR Cas12a至CRISPR Cas12e和CRISPR Cas9相比，CRISPR Cas14a至Cas14c系统的长度分布。

（D） 与CRISPR Cas9蛋白和CRISPR Cas12a蛋白相比，CRISPR Cas14a蛋白的结构域组织。颜色指示了核酸酶结构域（RuvC和HNH）。蛋白质长度按比例绘制。

我们鉴定的CRISPR Cas14蛋白几乎完全发生在DPANN内，DPANN是一种共生古细菌的超系，其特征在于小细胞和基因组大小。系统发育比较表明，Cas14蛋白种类繁多，与C2c10和C2c9相似，C2c10和C2c9是细菌RuvC结构域蛋白家族，有时在CRISPR阵列附近发现，但不与其他cas基因一起（图1B）。该观察结果和c2c10，c2c9和cas14蛋白的小尺寸使得这些系统不可能作为独立的CRISPR效应子起作用。

基于它们与负责创建感染遗传记忆的保守基因（cas1、cas2、cas4）接近，我们探索了CRISPR-Cas14蛋白系统是否能够主动获取DNA序列到其CRISPR阵列中。

多个CRISPR Cas14基因座的集合元基因组连续DNA序列（contigs）显示，其他相同的CRISPR系统在其CRISPR阵列中表现出多样性。

这些结果与对新感染的主动适应是一致的，尽管没有纵向取样，这些数据也可以用替代的生物学机制来解释（图2A）。

有证据表明获得了新的DNA序列，这使得我们设想这些CRISPR/Cas14基因座编码具有核酸靶向活性的功能酶，尽管它们的大小很小。

为了验证这种可能性，我们首先研究了RNA成分是否来自CRISPR Cas14基因座。对来自包含CRISPR Cas14a蛋白的本地古细菌宿主的RNA（图2B），分析环境转录组测序数据。

除了crispr RNA（crRNAs）外，一个高度丰富的非编码RNA被定位到CRISPR cas14a蛋白和相邻CRISPR阵列之间的~130碱基对序列上。

值得注意的是，该转录本的3′端主要与crRNA的重复片段互补（图2C），就如与CRISPR Cas9、Cas12b和Cas12e CRISPR系统相关的反式激活CRISPR RNA（tracrRNAs）所观察到的。

在这些先前研究的系统中，双链RNA切割酶核糖核酸酶III（RNase III）产生成熟的tracrRNAs和crRNAs，但是在含有重建基因组的CRISPR cas14蛋白中不存在编码RNase III的基因，并且当进行生物化学测试时，CRISPR Cas14a蛋白也没有切割其自身的pre-crRNA。

这些观察结果表明，CRISPR相关RNA加工的另一种机制存在于这些宿主中。

图2 CRISPR-Cas14a主动适应并编码tracrRNA。

（A）CRISPR Cas14b4和Cas14b14与CRISPR重复序列的间隔区多样性以棕褐色绘制，不同颜色显示不同的间隔区。

（B） Metatranscriptomic读取映射到CRISPR Cas14a1和Cas14a3基因座。插图显示了最丰富的重复序列和间隔序列的扩展视图。nt，核苷酸。

（C） 计算机预测CRISPR Cas14a1 crRNA和tracrRNA的结构。值得注意的是，在宿主基因组中未鉴定出RNase III直向同源物。

（D） 由RNA和蛋白质组成的各种CRISPR复合物质量的分数。

为了测试CRISPR Cas14a蛋白和相关RNA组分是否可以在异源生物体中组装在一起，我们将质粒引入含有最小CRISPR Cas14a基因座的大肠杆菌中，所述基因座包括cas14基因，CRISPR阵列和含有推定tracrRNA的基因间区域。

来自细胞裂解物的CRISPR Cas14a蛋白的亲和纯化和共纯化RNA的测序揭示了高度丰富的成熟crRNA以及推定的tracrRNA，尽管其相对丰度低于环境转录组学所显示的，表明Cas14与crRNA和tracrRNA相关。

组装的CRISPR Cas14a蛋白-tracrRNA-crRNA颗粒的质量计算为: RNA占重量的48%，而化脓性链球菌Cas9（SpCas9蛋白）仅为17%，新弗朗西斯菌Cas12a（FnCas12a）仅为8%（图2D），显示了RNA在Cas14a复合体结构中的核心作用。

已知的2类CRISPR系统需要称为原型间隔区相邻基序PAM的短序列来靶向双链DNA（dsDNA）。

为了测试CRISPR Cas14a是否需要PAM、并且可以进行dsDNA干扰，我们用含有随机PAM区的dsDNA质粒转化表达最小Cas14a基因座的大肠杆菌，所述随机PAM区紧邻与Cas14阵列中的靶编码序列（间隔区）匹配的序列。

值得注意的是，在大肠杆菌转化体中未检测到PAM序列的消耗，表明CRISPR Cas14a蛋白系统不能靶向dsDNA，可以在不需要PAM的情况下这样做，或者在该异源宿主中无活性。

我们接下来测试了纯化的Cas14a-tracrRNA-crRNA复合物是否能够在体外进行RNA引导的核酸切割。

目前所有针对2类干扰复合物的重组DNA都能够识别dsDNA和单链DNA（ssDNA）底物。

我们将纯化的Cas14a-tracrRNA-crRNA复合物与带有与crRNA指导序列或非互补ssDNA互补的20个核苷酸序列的放射性标记的靶寡核苷酸（ssDNA，dsDNA和ssRNA）一起温育，

并且我们分析了这些底物的Cas14a蛋白介导的切割。仅在存在互补ssDNA底物的情况下,才检测到切割产物（图3A），并且切割取决于tracrRNA和crRNA的存在，其也可以组合成单个指导RNA（sgRNA）（图3B）。

缺乏可检测的dsDNA切割表明Cas14a蛋白选择性地靶向ssDNA，尽管一些其他宿主因子或序列要求可能使天然宿主中的dsDNA识别成为可能。

CRISPR Cas14a蛋白 RuvC结构域中保守活性位点残基的突变消除了切割活性，暗示RuvC是负责DNA切割的结构域。

此外，CRISPR Cas14a DNA切割对RNA组分的截短敏感，其长度短于天然产生的序列。

这些结果证实CRISPR Cas14a蛋白是迄今为止证明进行可编程RNA引导的DNA切割的最小的2类CRISPR效应子。  

图3 CRISPR-Cas14a蛋白是RNA引导的DNA内切核酸酶。

（A） 靶向ssDNA，dsDNA，ssRNA和脱靶ssDNA的Cas14a1的切割动力学。

（B） 在各种RNA组分存在下，与靶ssDNA结合的Cas14a RNP图和放射性标记的ssDNA的Cas14a1切割动力学。

（C） 通过Cas14a1指导序列平铺ssDNA底物。

（D） 用活化的Cas14a1切割ssDNA病毒M13基因组。

虽然我们无法在体内鉴定dsDNA PAM，但我们通过在ssDNA底物上平铺CRISPR Cas14a向导, 来测试Cas14a蛋白是否需要PAM用于体外ssDNA切割（图3C）。

尽管与这些不同向导的靶标相邻的序列发生变异，我们观察到所有四个序列的切割。值得注意的是，切割位点发生在ssDNA的引导互补区域之外，并响应于引导结合位置而移入区域（图3C）。

这些数据表明Cas14a蛋白是靶向CRISPR内切核酸酶的ssDNA，其不需要PAM来激活。

基于CRISPR Cas14a蛋白切割靶向异源双链体的crRNA/DNA之外的观察结果，我们假设Cas14a可能具有靶向激活的非特异性ssDNA切割活性，类似于含有RuvC的酶Cas12a。

为了测试这种可能性，我们将Cas14a-tracrRNA-crRNA与互补的激活DNA、以及与Cas14a-crRNA或激活没有序列互补性的M13噬菌体ssDNA的等分试样一起温育（图3D）。

M13 ssDNA迅速降解为小片段，这个活性被保守的Cas14a蛋白 RuvC活性位点突变消除，表明Cas14a的活化导致非特异性ssDNA降解。

然而，当我们在大肠杆菌中异源表达CRISPR Cas14a蛋白时，我们无法观察到Cas14a介导的对ssDNA噬菌体ΦX174的干扰，可能是由于大肠杆菌和Cas14a的天然古细菌宿主之间的差异。

为了研究Cas14a蛋白对靶标依赖性非特异性DNA切割活性的特异性，我们采用了荧光猝灭（FQ）测定法，其中染料标记的ssDNA的切割产生荧光信号（图4A）。

当Cas14a蛋白与各种指导RNA-靶标ssDNA对一起温育时，仅在存在同源靶标的情况下观察到荧光信号，并且显示出对更长的含FQ底物的强烈偏好（图4A）。

我们接下来通过在各种ssDNA底物中的靶区域上平铺2个核苷酸错配来测试Cas14a错配耐受性。

令人惊讶的是，ssDNA靶标中间附近的错配强烈抑制Cas14a蛋白活性，揭示了与dsDNA靶向CRISPR Cas系统观察到的PAM近端种子区域不同的内部种子序列（图4B）。此外，含有强二级结构的DNA底物导致Cas14a蛋白的活化减少。ssDNA底物的截短也导致减少或不可检测的反式切割。总之，这些结果表明了一种不同于dsDNA靶向2类CRISPR系统的保真度机制，可能使用了类似于ssRNA靶向Cas13a蛋白酶的机制。

图4通过CRISPR Cas14a蛋白检测高保真ssDNA SNP。

（A）用 Cas14a1检测单链ssDNA的荧光猝灭FQ实验，以及不同长度荧光猝灭底物的裂解动力学。

（B） Cas14a1的切割动力学，错配平铺在基板上（单个点代表重复测量）。kObs，观测速率常数。

（C） Cas14-DETECTR 策略和HERC2眼色SNP图。

（D） T7核酸外切酶的滴定及对Cas14a-DETECTR的影响。Bkgd，背景。

（E） 用Cas14a-DETECTR检测蓝眼和棕眼个体唾液样本中的单核苷酸多态性，并与用Cas12a蛋白检测单链ssDNA进行比较。

CRISPR Cas12a蛋白的靶标依赖性，非特异性DNase酶活性可以用作DNA检测平台（DNA内切核酸酶靶向的CRISPR反式报告子，或DETECTR）。

尽管Cas12a蛋白在区分ssDNA底物方面表现出低保真度，但Cas14a蛋白需要种子区域中的互补以用于ssDNA底物识别。这种改善的特异性提高了使用Cas14a蛋白进行DNA单核苷酸多态性（SNP）的高保真检测，而不受PAM序列限制的可能性。

为了验证这一想法，使用含硫代磷酸酯（PT）的引物扩增了DNA底物，以保护一条链免受核酸外切酶的降解。

加入T7核酸外切酶后，未修饰的链被降解，留下可被Cas14a蛋白检测到的ssDNA底物（图4，C和D）。

作为原理证明，我们旨在检测人HERC2基因，该基因包含负责眼睛颜色的SNP。我们使用上述PT扩增方法，从蓝眼和棕眼个体的人唾液中的DNA扩增了HERC2基因。

当用靶向蓝眼SNP的指导RNA编程时，Cas12a蛋白不能区分两个ssDNA靶标，在两种情况下都表现出强烈的反式活性，

而Cas14a蛋白在识别带有针对棕色眼睛样本的近背景信号的蓝眼SNP时表现出强烈的活性（图4E）。

Cas14-DETECTR开发的产品允许基于CRISPR的医学和生态学上重要的ssDNA病原体的检测，以及SNP的高保真检测，而不受PAM序列的限制。

在宏基因组数据中对紧凑型V系统的进一步研究揭示了大量多样性的CRISPR系统，如Cas14a至Cas14c，

包括编码含有相邻Cas蛋白的短的RuvC的蛋白质的基因河CRISPR阵列。我们在各种未培养的微生物中发现了另外20个这样的系统，这些系统聚集成五个主要家族, Cas14d至Cas14h。

排除与cas12b蛋白相关的cas14g，cas14蛋白类基因在V型效应系统发育上形成单独的进化枝，表明这些家族是从TnpB的独立驯化进化而来的，TnpB是转座酶相关蛋白，这种可能是V型CRISPR效应子的进化祖先。

其相关cas1基因的系统发育重建表明，它们对于cas14亚型也具有不同的起源。

总之，我们确定了属于8个家族（Cas14a至Cas14h）的38个CRISPR-Cas14蛋白系统和另外8个无法与我们的分析聚类的系统（称为Cas14u）。目前，一些成熟的CRISPR Cas14蛋白产品已经开发出来，例如Magigen Cas14a1系列。

Cas14蛋白的小尺寸及其与V型效应蛋白的相似性表明，RNA引导的ssDNA切割可能已经作为祖传的2类CRISPR系统存在。

在这种情况下，一个小的、驯化的TnpB类ssDNA干扰复合物可能随着时间的推移获得了额外的结构域，逐渐改善了dsDNA的识别和切割。

与此假设相关，这种较小的Cas9蛋白直向同源物跟比较大的对应品种相比，表现出更弱的dsDNA靶向活性，但保留了强力切割ssDNA的能力。

除了进化意义之外，CRISPR Cas14蛋白特异性靶向ssDNA的能力表明，在防御ssDNA病毒或通过ssDNA中间体传播的移动遗传元素方面发挥作用。

靶向ssDNA的CRISPR系统在某些生态系统中特别有利，其中ssDNA病毒构成绝大多数病毒丰度。

这些微型CRISPR蛋白可以进行靶向DNA切割的意外发现，突出了隐藏在非培养生物中的CRISPR系统的多样性。

正在进行的对这些少数微生物谱系的探索，可能会继续揭示微观世界生存竞争、新的意想不到的发现，并带来有价值的、CRISPR技术的持续发展。

参考文献

Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes

Lucas B. Harrington,David Burstein,Janice S. Chen, Paez-Espino, Enbo Ma, Isaac P. Witte, Joshua C. Cofsky, Nikos C. Kyrpides, Jillian F. Banfield,   Jennifer A. Doudna

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