什么是细胞转染?细胞转染的方法和基本原理

什么是细胞转染

细胞转染，英文是Cell Transfection，是通过非病毒方法将核酸引入真核细胞的过程。细胞转染技术使用各种化学或物理方法，可以在细胞环境中研究基因功能和蛋白质表达。报告基因系统、转染DNA稳定维持和表达的选择方法的发展极大地扩展了细胞转染的应用。基于测定的报告基因技术，以及各种转染试剂的可用性，为研究哺乳动物启动子和增强子序列、转录因子等反式作用蛋白、mRNA加工、蛋白质：蛋白质相互作用、翻译和重组事件奠定了基础。

细胞转染是指将外源DNA或RNA导入目标细胞中的过程。这一过程可以通过多种方法实现，包括化学法转染、物理法转染、生物法转染等。细胞转染技术在生命科学研究中具有广泛的应用，例如基因表达研究、功能研究、基因治疗和药物开发等。通过转染，可以实现基因编辑、蛋白质表达、信号传导研究等，为揭示细胞机制、开发新药和治疗疾病提供了重要工具。

真核生物的转录发生在细胞核中，蛋白质合成发生在细胞质中。因此，一个真核信使RNA必须从细胞核中被运出来才能被翻译成多肽。而原核细胞没有细胞核，所以它们的转录和翻译都在细胞质中进行。

图1.真核&原核细胞转录和RNA加工流程

细胞转染的种类

细胞转染主要分为

1. 瞬时转染

2. 稳定转染：

什么是稳定转染？

稳定转染，英文是stable transfection，是指将外源DNA导入细胞中，目的基因能够入核，并整合到宿主细胞基因组中，通过药物加压筛选，只保留成功转染的阳性细胞，使其在细胞分裂和传代过程中持续稳定地存在和表达。通过稳定转染，外源DNA能够遗传给后代细胞，使得宿主细胞能够长期表达外源基因，甚至在细胞分裂后仍能保持这种表达能力，从而实现长期的基因表达。

在稳定转染过程中，外源核酸被整合到宿主细胞的基因组中，或者以自主复制的质粒形式存在。

为了筛选出成功整合了外源DNA的细胞，通常会使用抗生素抗性等标记来进行选择。

什么是瞬时转染？

瞬时转染，英文是transient transfection，是指将外源DNA或RNA导入细胞中，使其在一段短的时间内进行高效表达，但是不会整合到细胞基因组中，不能随细胞传代而持续稳定表达。因此，随着细胞的分裂，外源核酸逐渐丢失，表达也会随之消失。瞬时转染通常使用化学转染试剂或物理方法（如电穿孔、微注射等）导入外源DNA，并使其在短暂的时间内表达所需的蛋白质。瞬时转染常用于快速评估基因功能或蛋白质特性，不需要长期表达的情况。

图1. 化学转染机制：（A）转染试剂；（B） 核酸序列；（C） 化学转染试剂复合核酸；（D） 多聚体的细胞摄取和引入的核酸片段的表达

稳定转染和瞬时转染有何异同

相同点：

针对质粒DNA，不论是瞬时转染还是稳定转染，都可以通过物理法（电转、显微注射、基因枪），化学法（阳离子脂质体，阳离子聚合物、磷酸钙），生物法（病毒介导）进行转染；并且转染环节的操作基本一致。

差异点：

稳转细胞株构建所用质粒，一定是包含抗性基因，便于后续加压筛选；瞬转所用的质粒可以包含抗性基因也可以不包含抗性基因。

常用细胞转染方法及应用

目前转染方法主要包括物理方法、化学方法及生物方法，转染方法的选择取决于细胞类型以及研究目的，即使相同的细胞，不同的转染试剂之间也有较大差异，所以在使用新细胞系时，系统评估转染条件至关重要。

表1. 各种细胞转染技术对比 (美格生物) magigen.com

瞬时转染和稳定转染常见误区

误区一

只有慢病毒感染才能构建稳转细胞株

能够用来做瞬转的转染方法，都可以用来做稳转细胞株构建，比如电转、化学试剂转染、慢病毒感染等，只不过三种转染方法在具体的应用上会有一定差异。

需要注意的是RNA转染，由于RNA不需要入核，所以针对RNA转染一般只是做瞬转表达。

误区二

稳定转染目的基因会整合到染色体，瞬时转染不会

首先, 我们要了解基因从DNA到蛋白质的过程：DNA被转运至细胞后会入核，DNA在细胞核内，根据碱基互补配对原则，和基因的选择性表达等，转录出mRNA；mRNA通过核孔来到细胞质中的核糖体上，通过高尔基体，内质网等加工，在空间上通过折叠，反转，螺旋等方式形成空间结构。从而形成具有生物活性的蛋白质。一般会分为胞内表达、分泌型、单次跨膜及多次跨膜不同形态。

所以, 不管是瞬转还是稳转，DNA都会入核, 有一定概率会随机整合到宿主染色体；**的区别在于，稳转所用的质粒含有抗性基因，后期是通过药物筛选，把没有转进目的基因的细胞杀死，保留下来的就是成功转入目的基因的细胞。所以，通过一定时间的药物筛选，保存下来的细胞都是能够稳定遗传的细胞，称之为稳定转染；而瞬时转染由于没有药物加压筛选，加上仅有少量的细胞中有目的基因整合到染色体，所以，在传代的过程中，阳性细胞会越来越少，导致表达量逐渐降低，进而不能长期稳定表达。

误区三

构建稳转细胞株费时费力，周期长，不确定性高，常规实验室不方便构建

1、细胞株构建需要通过药物加压筛选，与瞬转相比周期长，但在进行科学研究时，确定了一个长期研究的靶标，后续都会针对某一基因进行相关实验，那么这个时候构建稳转细胞株就显得尤为必要，毕竟细胞株相较于瞬转来说，**的优点就是表达稳定性高，批间差异小，实验结果可靠性更高。

2、有的细胞转染效率比较低，通过瞬转的方式，很难获得足够的阳性细胞进行实验，通过构建细胞株，就可以提高阳性率，获得足量稳定过表达的细胞株。

3、有的人可能会觉得构建细胞株周期太久，结果不可控；其实，在我们构建细胞株时，通常会在转染后48h进行表达量检测以及初步的功能验证，这个时候我们就可以知道是否转染成功，就可以知道细胞株构建是否会成功；至于操作难度，这里也可以给大家分享实验protocol（具体操作如下）。

稳转细胞株构建操作流程：

1、重组质粒构建：按照实验室的需求，将目的基因构建到含有抗性基因的载体中（如pLVX-puro），进行无内毒素质粒抽提，获得目的质粒，最终拿到的质粒，浓度**不低于1000 ng/μL，浓度过低会影响转染效率。

2、细胞准备：在转染前一天传代细胞，保证在第二天能够有70%左右的汇合度（具体情况可根据细胞而定）。

3、细胞转染：按照转染试剂说明书进行细胞转染即可。

4、细胞检测：转染后48h，取部分细胞进行表达量或功能检测，初步判断是否转染成功，若失败，查找失败原因；若成功，则进行后续实验。

5、细胞铺板：细胞计数后，按照10/100/1000个细胞每孔铺板96孔板（铺板数量可以梯度测试），铺板培养基需要含有筛选药物；不建议直接在原细胞中直接加入药物进行筛选，这样会降低细胞存活率。

6、克隆挑选：细胞铺板后14天，显微镜观察克隆生长情况，并将阳性克隆移至12孔板继续培养（根据细胞量转移到合适的细胞培养板即可）。

7、克隆检测：按照实验室检测方法进行表达量或功能验证，筛选出若干个优选克隆继续传代培养，待细胞大量扩培后，可再进行一次复检。

8、细胞建库：按照实验需求进行细胞建库，如果需要构建单克隆细胞株，可以在优选克隆基础上按照单个细胞每孔进行二轮筛选。

细胞转染常见问题解答FAQ

问：通过多种转染方式均无法提高转染效率，应该怎么解决？

如果瞬转效率比较低，这时会推荐构建稳转细胞株，可以通过药物加压筛选，获得稳定过表达的细胞株，提高阳性率，解决转染效率低的问题。如果是比较难转染的细胞，可以参考使用Magigen Lumiere   Cas9/sgRNA NPs, 该产品可以对一些难转染的细胞进行高效转染，效率高达50-100%, 而且毒性低，适合原代细胞转染。

问：一般情况下，哪些因素会影响细胞转染效率？

质粒：首先要确保我们序列的准确性，其次是质粒的高纯度；质粒浓度**不低于1000 ng/uL（该浓度只是建议浓度，低浓度也可以成功转染，只不过转染效率会有所降低）。

细胞类型：要保证是一个健康状态的细胞；不同细胞类型对转染方法和试剂的敏感性不同，因此转染效率也会有差异。

转染方法：按照转染试剂说明书要求进行转染条件摸索，确定**转染条件。

问：如何选择合适的转染方法

目前主要有物理方式，化学试剂及病毒等转染方式；通常物理转染需要昂贵的仪器及复杂的转染参数，一般实验室无法满足；化学试剂是目前比较通用的一种方法，因其价格便宜，操做简单，被广泛使用，不过该类产品一般只能转染比较常规的细胞，针对个性化肿瘤细胞其转染效率会下降，所以针对较难转染的细胞，主要是通过慢病毒进行转染；当然，如果细胞本身就是那种非常难转染的，慢病毒也不一定会有很高的转染效率。

问：报告基因细胞株如何构建

报告基因细胞株构建流程和上述细胞株构建方法基本一致，首先需要确定所用报告基因质粒是正确（涉及到具体的信号通路），根据细胞类型，选用适合的转染方法，按照质粒载体上标注的抗性基因进行药物筛选即可。

问：稳转细胞株构建是否需要将质粒线性化

不需要，质粒线性化和未线性化均可，亲测两种差异不大。

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