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什么是细胞转染?细胞转染的方法和基本原理

作者:细胞转染

什么是细胞转染

细胞转染,英文是Cell Transfection,是通过非病毒方法将核酸引入真核细胞的过程。细胞转染技术使用各种化学或物理方法,可以在细胞环境中研究基因功能和蛋白质表达。报告基因系统、转染DNA稳定维持和表达的选择方法的发展极大地扩展了细胞转染的应用。基于测定的报告基因技术,以及各种转染试剂的可用性,为研究哺乳动物启动子和增强子序列、转录因子等反式作用蛋白、mRNA加工、蛋白质:蛋白质相互作用、翻译和重组事件奠定了基础。


细胞转染是指将外源DNA或RNA导入目标细胞中的过程。这一过程可以通过多种方法实现,包括化学法转染、物理法转染、生物法转染等。细胞转染技术在生命科学研究中具有广泛的应用,例如基因表达研究、功能研究、基因治疗和药物开发等。通过转染,可以实现基因编辑、蛋白质表达、信号传导研究等,为揭示细胞机制、开发新药和治疗疾病提供了重要工具。


真核生物的转录发生在细胞核中,蛋白质合成发生在细胞质中。因此,一个真核信使RNA必须从细胞核中被运出来才能被翻译成多肽。而原核细胞没有细胞核,所以它们的转录和翻译都在细胞质中进行。

真核&原核细胞转录和RNA加工流程1.png


图1.真核&原核细胞转录和RNA加工流程


细胞转染的种类

细胞转染主要分为

1. 瞬时转染

2. 稳定转染:


什么是稳定转染?

稳定转染,英文是stable transfection,是指将外源DNA导入细胞中,目的基因能够入核,并整合到宿主细胞基因组中,通过药物加压筛选,只保留成功转染的阳性细胞,使其在细胞分裂和传代过程中持续稳定地存在和表达。通过稳定转染,外源DNA能够遗传给后代细胞,使得宿主细胞能够长期表达外源基因,甚至在细胞分裂后仍能保持这种表达能力,从而实现长期的基因表达。

在稳定转染过程中,外源核酸被整合到宿主细胞的基因组中,或者以自主复制的质粒形式存在。

为了筛选出成功整合了外源DNA的细胞,通常会使用抗生素抗性等标记来进行选择。


什么是瞬时转染?

瞬时转染,英文是transient transfection,是指将外源DNA或RNA导入细胞中,使其在一段短的时间内进行高效表达,但是不会整合到细胞基因组中,不能随细胞传代而持续稳定表达。因此,随着细胞的分裂,外源核酸逐渐丢失,表达也会随之消失。瞬时转染通常使用化学转染试剂或物理方法(如电穿孔、微注射等)导入外源DNA,并使其在短暂的时间内表达所需的蛋白质。瞬时转染常用于快速评估基因功能或蛋白质特性,不需要长期表达的情况。


美格生物细胞转染示意图1.png

图1. 化学转染机制:(A)转染试剂;(B) 核酸序列;(C) 化学转染试剂复合核酸;(D) 多聚体的细胞摄取和引入的核酸片段的表达


稳定转染和瞬时转染有何异同

相同点:

针对质粒DNA,不论是瞬时转染还是稳定转染,都可以通过物理法(电转、显微注射、基因枪),化学法(阳离子脂质体,阳离子聚合物、磷酸钙),生物法(病毒介导)进行转染;并且转染环节的操作基本一致。

差异点:

稳转细胞株构建所用质粒,一定是包含抗性基因,便于后续加压筛选;瞬转所用的质粒可以包含抗性基因也可以不包含抗性基因。


常用细胞转染方法及应用

目前转染方法主要包括物理方法、化学方法及生物方法,转染方法的选择取决于细胞类型以及研究目的,即使相同的细胞,不同的转染试剂之间也有较大差异,所以在使用新细胞系时,系统评估转染条件至关重要。

转染类别

转染方法

实验原理特点应用
物理法

电转

利用短暂的电脉冲使细胞膜发生瞬时通透性增加,从而使外源DNA、RNA能够进入细胞物理方法,不会引入外源物质,需要电转仪,仪器价格昂贵;同时针对不同细胞系,均需要系统摸索**转染条件目前主要用于大规模蛋白表达及抗体蛋白细胞株构建

基因枪

利用高速微粒冲击,将外源DNA送入细胞内机械损伤较大,需要仪器特定细胞的转染

显微注射利用显微镜和注射器将外源DNA、RNA直接注入目标细胞主要用于单个或少量细胞,对实验人员手法要求较高主要是单细胞操作,定点基因编辑
化学法阳离子脂质体阳离子脂质体的正电荷特性与负电荷的核酸或蛋白质形成复合物,经胞吞作用进入细胞,释放外源物质。操作简单、价格便宜,在多种细胞上均可实现有效转染,有一定细胞毒作用,针对原代细胞或其他难转的个性化肿瘤细胞转染效率比较低实验室最常用的转染试剂,可用来做各种瞬转或细胞株构建

阳离子聚合物带正电的聚合物与带负电的磷酸基团形成复合物后,与细胞表面带负电的蛋白质和多糖相互作用,通过内吞作用进入细胞。操作简单、转染效率高,细胞毒性更低,可用于病毒载体制备,适合大规模生产使用病毒载体生产、蛋白表达、科研常用细胞系转染

磷酸钙磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜,被细胞内吞

成本低,操作简单,转染结果重复性较差,针对难转细胞转染效率低

常规细胞转染
生物法病毒介导法将外源基因序列插入病毒载体的适当位点上,构建表达载体,包装病毒,通过病毒感染细胞,将目的基因带入胞内转染效率高,适用于难转染细胞,需要提前包装病毒,实验周期及难度偏高适用于难转染细胞,可用于稳转细胞株构建

表1. 各种细胞转染技术对比 (美格生物) magigen.com

瞬时转染和稳定转染常见误区

误区一

只有慢病毒感染才能构建稳转细胞株

能够用来做瞬转的转染方法,都可以用来做稳转细胞株构建,比如电转、化学试剂转染、慢病毒感染等,只不过三种转染方法在具体的应用上会有一定差异。

需要注意的是RNA转染,由于RNA不需要入核,所以针对RNA转染一般只是做瞬转表达。


误区

稳定转染目的基因会整合到染色体,瞬时转染不会

首先, 我们要了解基因从DNA到蛋白质的过程:DNA被转运至细胞后会入核,DNA在细胞核内,根据碱基互补配对原则,和基因的选择性表达等,转录出mRNA;mRNA通过核孔来到细胞质中的核糖体上,通过高尔基体,内质网等加工,在空间上通过折叠,反转,螺旋等方式形成空间结构。从而形成具有生物活性的蛋白质。一般会分为胞内表达、分泌型、单次跨膜及多次跨膜不同形态。

所以, 不管是瞬转还是稳转,DNA都会入核, 有一定概率会随机整合到宿主染色体;**的区别在于,稳转所用的质粒含有抗性基因,后期是通过药物筛选,把没有转进目的基因的细胞杀死,保留下来的就是成功转入目的基因的细胞。所以,通过一定时间的药物筛选,保存下来的细胞都是能够稳定遗传的细胞,称之为稳定转染;而瞬时转染由于没有药物加压筛选,加上仅有少量的细胞中有目的基因整合到染色体,所以,在传代的过程中,阳性细胞会越来越少,导致表达量逐渐降低,进而不能长期稳定表达。


误区三

构建稳转细胞株费时费力,周期长,不确定性高,常规实验室不方便构建

1、细胞株构建需要通过药物加压筛选,与瞬转相比周期长,但在进行科学研究时,确定了一个长期研究的靶标,后续都会针对某一基因进行相关实验,那么这个时候构建稳转细胞株就显得尤为必要,毕竟细胞株相较于瞬转来说,**的优点就是表达稳定性高,批间差异小,实验结果可靠性更高。

2、有的细胞转染效率比较低,通过瞬转的方式,很难获得足够的阳性细胞进行实验,通过构建细胞株,就可以提高阳性率,获得足量稳定过表达的细胞株。

3、有的人可能会觉得构建细胞株周期太久,结果不可控;其实,在我们构建细胞株时,通常会在转染后48h进行表达量检测以及初步的功能验证,这个时候我们就可以知道是否转染成功,就可以知道细胞株构建是否会成功;至于操作难度,这里也可以给大家分享实验protocol(具体操作如下)。

稳转细胞株构建操作流程:

1、重组质粒构建:按照实验室的需求,将目的基因构建到含有抗性基因的载体中(如pLVX-puro),进行无内毒素质粒抽提,获得目的质粒,最终拿到的质粒,浓度**不低于1000 ng/μL,浓度过低会影响转染效率。


2、细胞准备:在转染前一天传代细胞,保证在第二天能够有70%左右的汇合度(具体情况可根据细胞而定)。


3、细胞转染:按照转染试剂说明书进行细胞转染即可。


4、细胞检测:转染后48h,取部分细胞进行表达量或功能检测,初步判断是否转染成功,若失败,查找失败原因;若成功,则进行后续实验。


5、细胞铺板:细胞计数后,按照10/100/1000个细胞每孔铺板96孔板(铺板数量可以梯度测试),铺板培养基需要含有筛选药物;不建议直接在原细胞中直接加入药物进行筛选,这样会降低细胞存活率。


6、克隆挑选:细胞铺板后14天,显微镜观察克隆生长情况,并将阳性克隆移至12孔板继续培养(根据细胞量转移到合适的细胞培养板即可)。


7、克隆检测:按照实验室检测方法进行表达量或功能验证,筛选出若干个优选克隆继续传代培养,待细胞大量扩培后,可再进行一次复检。


8、细胞建库:按照实验需求进行细胞建库,如果需要构建单克隆细胞株,可以在优选克隆基础上按照单个细胞每孔进行二轮筛选。


细胞转染常见问题解答FAQ

问:通过多种转染方式均无法提高转染效率,应该怎么解决?

如果瞬转效率比较低,这时会推荐构建稳转细胞株,可以通过药物加压筛选,获得稳定过表达的细胞株,提高阳性率,解决转染效率低的问题。如果是比较难转染的细胞,可以参考使用Magigen Lumiere   Cas9/sgRNA NPs, 该产品可以对一些难转染的细胞进行高效转染,效率高达50-100%, 而且毒性低,适合原代细胞转染。


问:一般情况下,哪些因素会影响细胞转染效率?

质粒:首先要确保我们序列的准确性,其次是质粒的高纯度;质粒浓度**不低于1000 ng/uL(该浓度只是建议浓度,低浓度也可以成功转染,只不过转染效率会有所降低)。

细胞类型:要保证是一个健康状态的细胞;不同细胞类型对转染方法和试剂的敏感性不同,因此转染效率也会有差异。

转染方法:按照转染试剂说明书要求进行转染条件摸索,确定**转染条件。


问:如何选择合适的转染方法

目前主要有物理方式,化学试剂及病毒等转染方式;通常物理转染需要昂贵的仪器及复杂的转染参数,一般实验室无法满足;化学试剂是目前比较通用的一种方法,因其价格便宜,操做简单,被广泛使用,不过该类产品一般只能转染比较常规的细胞,针对个性化肿瘤细胞其转染效率会下降,所以针对较难转染的细胞,主要是通过慢病毒进行转染;当然,如果细胞本身就是那种非常难转染的,慢病毒也不一定会有很高的转染效率。


问:报告基因细胞株如何构建

报告基因细胞株构建流程和上述细胞株构建方法基本一致,首先需要确定所用报告基因质粒是正确(涉及到具体的信号通路),根据细胞类型,选用适合的转染方法,按照质粒载体上标注的抗性基因进行药物筛选即可。


问:稳转细胞株构建是否需要将质粒线性化

不需要,质粒线性化和未线性化均可,亲测两种差异不大。


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