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逆转录酶从入门到精通什么是逆转录酶？OR 什么是反转录酶？逆转录酶，英文名是Reverse Transcriptase，又称反转录酶，RT酶。逆转录酶是RNA指导的DNA聚合酶。反转录酶以RNA为模板，以dNTP为底物，tRNA( 主要是色氨酸tRNA) 为引物，在tRNA 3'-OH 末端上，根据碱基配对的原则，按5'-3'方向合成一条与RNA 模板互补的单链DNA ，这条DNA 单链叫做互补DNA (complementary DNA，cDNA)。含有逆转录酶的病毒叫做反转录病毒，逆转录酶催化的反应叫反转录（reverse transcription）。在这个过程中，遗传信息流动的方向是从RNA到DNA，正好与转录过程相反，故称反转录。
图1. 野生型HIV-1逆转录酶晶体结构. 根据PDB: 3KLF绘制 逆转录酶的历史逆转录酶是怎样被发现的？ 1970年，美国科学家特明（H.M.Temin）和巴尔的摩（D.Baltimore）两人各自都从酵素中发现反转录的反应，将此命名为逆转录酶, RT酶。逆转录酶首先是由霍华德·马丁·特明在劳氏肉瘤病毒中发现的，同年，由·巴尔的摩独立从两种RNA肿瘤病毒：R-MLV以及在劳氏肉瘤病毒中分离出来。由于这些发现RT酶的成就，两人在1975年共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。 逆转录病毒是怎样工作的呢？ 逆转录的原理科学家经过研究，发现了反转录的原理：当RNA致癌病毒，如鸟类劳氏肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus）进入宿主细胞后，其逆转录酶先催化合成与病毒RNA互补的DNA单链，继而复制出双螺旋DNA，并经另一种病毒酶的作用整合到宿主的染色体DNA中，这个整合的DNA可能会潜伏数代，不表达，等到适合的条件时被激活，再利用宿主的酶系统转录成相应的RNA，其中一部分作为病毒的遗传物质，另一部分则作为mRNA翻译成病毒特有的蛋白质。最后，RNA和蛋白质被组装成新的病毒粒子。在一定的条件下，整合的DNA也可使细胞转化成癌细胞。 后来发现，逆转录酶不仅存在于某些RNA病毒，也存在于哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞。
反转录酶有哪些活性？逆转录酶具有三种酶活性
逆转录酶的种类 自然界有许多逆转录酶，目前人们研究比较多的逆转录酶包括：
在病毒中反转录酶的作用病毒将逆转录作为复制过程中的一个步骤，编码和使用反转录酶。进行反转录的RNA病毒，如逆转录病毒，利用这种酶将其RNA基因组反转录成DNA，然后DNA被整合到宿主基因组中，并与宿主基因组一起复制。 进行反转录的DNA病毒，如肝炎病毒，可以让RNA作为模板组装和制造DNA链。HIV病毒通过反转录酶感染人类。如果没有逆转录酶，病毒基因组将无法整合到宿主细胞中，导致复制失败。 逆转录过程或反转录的过程 在逆转录酶缺乏DNA依赖性DNA聚合酶活性的病毒物种中，双链DNA的产生可能由宿主编码的DNA聚合酶δ完成，误将病毒DNA-RNA当作引物，并通过与去除引物相似的机制合成双链DNA，新合成的DNA取代了原来的RNA模板。 反转录的过程，也被称为逆转录或逆转录，是极易出错的，正是在这一步，突变可能发生。这种突变可能导致耐药性。 逆转录病毒如何逆转录？ 逆转录病毒，也被称为6型ssRNA-RT逆转录病毒，是带有DNA中间体的RNA逆转录病毒。它们的基因组由两个带有5'帽和3'多聚腺苷酸化尾的正义单链RNA分子组成。 逆转录病毒的例子包括人类免疫缺陷病毒HIV和人类嗜T淋巴细胞病毒HTLV。双链DNA的产生在细胞质基质中发生，这包括以下一系列的步骤： 1. 赖氨酸tRNA，Lysyl tRNA ，作为引物，与病毒RNA基因组的互补部分（称为引物结合位点或PBS）杂交。 2. 逆转录酶将DNA核苷酸加到引物的3'端，合成与病毒RNA的U5区（非编码区）和R区（RNA分子两端的直接重复）互补的DNA。 3. 逆转录酶上的一个称为RNAse H的结构域降解RNA 5'端的U5和R区域。 4. 然后tRNA引物“跳”到病毒基因组的3'端，新合成的DNA链与RNA上的互补R区杂交。 5. 在步骤2加入的互补DNA, cDNA, 进一步扩展。 6. 大多数病毒RNA被RNAse H降解，只剩下PP序列。 7. 使用病毒RNA的剩余PP片段作为引物, 第二条DNA链的合成开始。 8. tRNA引物离开，一个“跳跃”发生。来自第二链的PBS与**链上的互补PBS杂交。 9. 两条链都被延伸，形成一个原始病毒RNA基因组的双链DNA的完整拷贝，然后通过整合酶将其整合到宿主基因组中。
图3. 逆转录在HIV中的作用机制. 双链DNA的产生还涉及到链转移，在链转移中，将来自最初的RNA依赖性DNA合成的短DNA产物转移到基因组另一端的受体模板区域，随后它的DNA依赖性DNA活性被逆转录酶处理。 逆转录病毒RNA从5'端到3'端排列。在引物结合位点PBS，引物退火，构建病毒RNA。 PBS位点的RNA 5'端称为U5，PBS的RNA 3'端称为前导。tRNA引物在14到22个核苷酸之间展开，并在PBS处与病毒RNA形成碱基配对双链。 事实上，PBS位于病毒RNA的5'末端附近是不寻常的，因为逆转录酶从引物的3'端开始，按5'端到3'端方向，合成DNA（相对于新合成的DNA链）。因此，引物和逆转录酶必须重新定位到病毒RNA的3'端。为了完成这种重新定位，需要多个步骤和多种酶，包括DNA聚合酶、核糖核酸酶RNase H和多核苷酸解旋。 HIV逆转录酶还具有核糖核酸酶活性，可在cDNA合成过程中降解病毒RNA，以及DNA依赖性DNA聚合酶活性，该活性可将正义cDNA链复制到反义DNA中，形成双链病毒DNA中间体（vDNA）。 在细胞生命中真核基因组的自我复制扩展区段，称为逆转座子，利用逆转录酶，通过RNA中间体，从基因组中的一个位置移动到另一个位置。 它们在植物和动物的基因组中被大量发现。端粒酶是在包括人在内的许多真核生物中发现的另一种逆转录酶，其携带其自身的RNA模板；该RNA用作复制DNA的模板。 早在1971年，法国的Beljanski等人最早报告了原核生物中的逆转录酶，几年后，苏联的Romashchenko也对逆转录酶进行了报告。从那以后，这些被广泛地描述为细菌逆转子的一部分，不同的序列编码逆转录酶，并用于合成msDNA。为了启动DNA的合成，需要一个引物。在细菌中，引物是在复制过程中合成的。俄勒冈州的Valerian Dolja认为，因其多样性，病毒在细胞生命的发展中起着进化作用，逆转录酶起着核心作用 。 逆转录酶/反转录酶（RT酶）的晶体结构
逆转录酶采用类似人的“右手”的结构，类似于在其他病毒核酸聚合酶中发现的结构。除了转录功能外，逆转录酶还具有属于RNase H家族的结构域，这对它们的复制至关重要。通过降解RNA模板，它可以合成另一条DNA链。一些来自消化的片段也可以作为DNA聚合酶（同一种酶或宿主蛋白）的引物，负责制造另外（增加的）链。 复制的保真度 在逆转录病毒的生命周期中有三种不同的复制过程。 首先，逆转录酶从病毒RNA合成病毒DNA，然后从新形成的互补DNA链合成病毒DNA。 第二个复制过程发生在宿主细胞DNA聚合酶复制整合的病毒DNA时。 最后，RNA聚合酶II将前病毒DNA转录成RNA，RNA将被包装成病毒粒子。 因此，这些复制步骤中的每一个或所有步骤都可能发生突变。 逆转录酶在将RNA转录到DNA中时有很高的错误率，因为它不像大多数其他DNA聚合酶，它没有校对能力。相对于校对形式的复制，这种高错误率使得突变以加速度累积。根据Promega公司生产的商用逆转录酶手册，其AMV酶的错误率在1/17000碱基，M-MLV酶的出错率是的1/30000碱基。除了产生单核苷酸多态性外，逆转录酶还参与转录融合、外显子改组和产生人工反义转录物等过程。据推测，逆转录酶的这种模板转换活性，这种活性在体内完全被证实，可能是在模式生物基因组中发现数千个未注释转录物的原因之一。 两个RNA基因组被包装到每个逆转录病毒质粒中，但在感染后，每个病毒只产生一个前病毒。感染后，逆转录伴随着两个基因组拷贝之间的模板转换（拷贝选择重组）。有两种模型可以解释为什么RNA转录酶会转换模板。 **种是强制拷贝选择模型，它认为逆转录酶在遇到缺口时会改变RNA模板，这意味着重组是维持病毒基因组完整性的必由之路。 第二个是动态选择模型，表明当RNAse功能和聚合酶功能在速率上不同步时，逆转录酶改变模板，这意味着重组是随机发生的，而不是对基因组损伤的反应。 Rawson等人的一项研究支持这两种重组模型。每个基因组在每个复制周期发生5到14个重组事件。模板转换（重组）似乎是维持基因组完整性和挽救受损基因组的修复机制所必需的。 逆转录酶应用 抗病毒药 由于艾滋病毒利用逆转录酶复制其遗传物质并产生新的病毒（逆转录病毒增殖循环的一部分），因此设计了特定的药物来破坏这一过程，从而抑制其生长。这些药物统称为逆转录酶抑制剂，包括核苷和核苷酸类似物齐多夫定（Retrovir）、拉米夫定（Epivir）和替诺福韦（Viread），以及非核苷抑制剂，如奈韦拉平（Viramune）。 分子生物学应用 逆转录酶常用于逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），一种将聚合酶链反应应用于RNA的技术。经典的PCR技术只能应用于DNA链，但在逆转录酶的帮助下，RNA可以被转录成DNA，从而使RNA分子的PCR分析成为可能。 逆转录酶也用于从mRNA中创建cDNA文库。逆转录酶的商业化应用极大地提高了分子生物学领域的知识，因为它与其他酶一起，使科学家能够克隆、排序和表征RNA。 逆转录酶也被用于胰岛素产品。通过在细菌中插入用于胰岛素产品的真核mRNA和逆转录酶，可以将mRNA插入到原核生物的基因组中。大量的胰岛素可以被制造出来，绕开了提取猪胰腺和其他传统的方法。 直接将真核细胞DNA插入细菌是行不通的，因为它携带内含子，所以不能利用细菌核糖体进行成功的翻译。在真核细胞mRNA产生过程中，处理过程去除了这些内含子，以提供合适的模板。逆转录酶将这个经过编辑的RNA转换回DNA，这样它就可以被整合到基因组中。 相关阅读
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