CAR-T基础知识:CART技术原理和发展

CAR-T（嵌合抗原受体T细胞） 药物是一种有生命的药物， 原理在于经嵌合抗原受体修饰的T细胞， 可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、 杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高， 从而发挥抗癌作用。 CAR-T细胞疗法在早期的临床试验中并没有表现出惊人的疗效， 然而随着抗CD19 CAR-T细胞疗法在B细胞恶性肿瘤中显示出的巨大潜力， CAR-T产品一时间成了抗肿瘤领域的新星。

什么是CAR-T细胞 ?

CAR-T细胞, 英文是chimeric antigen receptor T cell,   缩写为CAR-T，中文是嵌合抗原受体T细胞技术，它是过继细胞免疫治疗（adoptive cellular immunotherapy，ACI)的一种，通过基因改造技术， 让患者T细胞表达嵌合抗原受体， 使效应T细胞的靶向性、 杀伤性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态, 是一种特异性的免疫细胞抗肿瘤治疗。

T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌， 在肿瘤免疫应答中起重要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。

对T细胞进行基因工程处理， 从而在其表面表达能够识别特异性肿瘤抗原的特殊受体称为嵌合抗原受体（CAR） ， 同时在受体的胞内段可加上引起T细胞活化的信号传递区域。

肿瘤对患者的免疫系统具有抑制作用， 限制了自身免疫功能的诱导和激活， 因此可以把患者的免疫细胞放到一种可以避开肿瘤抑制因素的环境中进行激活和扩增， 然后再将扩增后的免疫细胞回输患者， 从而使患者的免疫功能迅速增强， 达到杀伤肿瘤细胞的作用，这种疗法就是过继性免疫疗法。

CAR-T技术原理：

嵌合抗原受体（CARs） 是由一个胞外抗原识别域（通常是一个单链抗体， 也可以是多肽或者其他蛋白质） 和一个胞内信号域组成。

CAR的胞外部分用来识别特异性的肿瘤抗原， 随后胞内信号域会刺激T细胞增殖， 并且通过细胞溶解和细胞因子释放来消除肿瘤细胞。

• **代CARs的胞内信号域是CD3ζ信号链（signal 1） ， 这一代产品在临床试验中效果有限， 可能由于移植T细胞的活化诱导细胞死亡（AICD） 或者T细胞扩增的持续性不好所导致。

• 第二代CARs相比**代CARs增加了一个胞内共刺激信号域（signal2） 。 在过去的5年里， 对于第二代含有CD28或者4-1BB(CD137) 共刺激信号域的抗CD19 CAR-T， 在治疗B淋巴细胞白血病的临床试验中都表现出优异的疗效， 但是仍然需要寻找更好的共刺激信号分子， 来解决第二代CAR-T产品作用不持久等问题。

• 第三代CARs不仅包含CD3ζ信号域， 还包括两个共刺激信号分子。

✿ CAR构成（1） ----scFV（单链抗体）

图1. CAR构成1

✿ CAR构成（2） ----TCR/CD3/ζ

图2. CAR构成2

✿ CAR构成（3） ---- co-stimulator

增殖与存活

表1. CAR构成3

CAR-T细胞的发展过程

• **代CAR-T细胞

✱ 发表时间： 1989 年；

✱ 嵌合受体的形成方法： Eshhar研究小组将免疫球蛋白样scFv和FcεRI受体(γ链)或CD3复合物(ζ链) 胞内结构域融合形成嵌合受体；

✱ 激活方式： 表达CAR的T细胞以抗原依赖、 非MHC限制的方式结合肿瘤抗原, 启动并活化特异性杀伤肿瘤反应；

✱ CARs 表达的稳定性依赖于所用的胞内信号域；

✱ 大多数试验在细胞扩增、 体内存活时间、 细胞因子分泌等方面存在不足， 治疗效果不明显。

图4. cart细胞的发展

Monoclonal antibody: 单克隆抗体;

TCR-CD3 complex: T细胞受体-CD3分子复合物;

Antigen-binding region: 抗原结合区;

Transmembrane region: 跨膜区;

Signal transduction reeion: 信号转导区;

Hinge area: 铰链区:

VH: 重链:

VL: 轻链;

Tumor antigen: 肿瘤抗原;

Tcell:T细胞。

大多数CAR包括胞外抗原结合区(由来源于单克隆抗体的轻链和重链组成,中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体)、跨膜区域(一般由同源或异源的CD3、CD8或CD28等二聚体膜蛋白组成)和胞内信号转导区(免疫受体酪氨酸活化基序, 通常为CD3ζ(或FcεRIγ)组成。

• 第二代CAR-T细胞

✱ 发表时间： 2010年；

✱ 嵌合受体的形成方法： T细胞的完全活化有赖于双信号*和细胞因子的作用。 因此， 依照T细胞活化的双信号学说, 第二和第三代CARs 在嵌合受体上加上如CD28、 CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子(costimulatory molecule, CM)， 以提高T细胞的细胞毒性、 增殖活性,

维持T细胞应答, 延长T细胞存活时间等（图2） ；

✱ CD28、 CD134对提高初始T细胞获得持久的体外增殖和较强的细胞因子分泌非常重要 ；

T细胞激活需要双信号

图5. T细胞激活需要的双信号

**信号为特异性信号, 由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动;

第二信号为协同刺激信号, 通过CD28/B7等重要的共刺激分子, 促进IL-2合成, 并使T细胞充分活化及免于凋亡。

• 第三代CAR-T 细胞

✱ 发表时间： 2012 年；

✱ 嵌合受体的形成方法： 以逆转录病毒为载体构建第三代CAR-T细胞(scFv CD20-CD28-CD137-CD3ζ） ；

✱ 两个共刺激因子， 进一步提高细胞增殖能力及细胞毒性

✱ 患者输注后4小时血液就检测出有高水平的IFN-γ、 GM-CSF、 TNF-α和IL-6 等细胞因子；

✱ 效应细胞在体内存活的时间超过12 个月 ；

✱ 由于目前第三代CAR-T细胞临床应用还比较少, 故其安全性和有效性是否就一定优于第二代CAR-T细胞, 以及选择怎样的共刺激分子组合, 还需进一步观察。

第二代和第三代CAR结构示意图

图6.   第二代和第三代CAR结构

图7. 第1、2、3代CART对比

**代CAR(左)由单链抗体通过跨膜区域与胞内信号传导区(ITAM)相连。ITAM通常为CD3ζ(或FcεRIγ；第二代CAR(中)的胞内信号转导区引入了共刺激分子CM1，主要为CD28分子；第三代CAR(右)引入了双共刺激分子(CM1和CM2，主要为CD28分子加上CD134或CD137。

• 第四代CAR-T细胞（ 展望）特点

整合自杀基因， 精确调控， 细胞因子释放（如IL-12） 激活等

• 第五代CAR-T细胞（ 展望）特点

通用CAR-T

CAR-T高度个性化

不便于cGMP管理

成本非常高

CAR-T技术中TAA概念

• TAA（ Tumor-Associated Antigen， 肿瘤相关抗原） ：

即肿瘤所表达的抗原， 是scFV的结合抗原， 对CAR-T起定向作用。

• Perfect TAA：

1. 仅存在于肿瘤表面， 不在任何正常组织中表达；

2. 为肿瘤生长所必需， 能产生强大的效力；

3. 不能通过免疫编辑和肿瘤逃逸而逃脱。

• TAA基本要求：

1. 抗原必须表达在细胞表面；

2. 肿瘤之外的抗原表达绝对不能在重要脏器或者细胞类型上（例如造血干细胞） ；

3. 为了防止抗原逃逸， 所有的肿瘤细胞都必须表达这个抗原， 换句话说， 抗原对于肿瘤维持其肿瘤特性来说是必需的。

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