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如何设置CRISPR Cas13a与恒温扩增检测反应体系作者：Jonathan 广州美格生物提供全系列的CRISPR Cas蛋白、恒温扩增试剂、逆转录酶、侧向层析试纸条，用于基因编辑、快速检测。想了解详情，请点击：CRISPR Cas蛋白、恒温扩增试剂、逆转录酶、侧向层析试纸条 重要提示：本方案以张锋实验室的CRISPR Cas13a检测方案为参考，只用于科学研究，不可以用于临床。 CRISPR Cas13a与恒温扩增反应体系设置A. 概述述 新型冠状病毒COVID-19可以通过qPCR进行诊断，但由于试剂和设备昂贵，疾病检测速度比较慢。为了提高COVID-19的诊断水平，我们在此介绍了一种基于张锋CRISPR的SHERLOCK技术与恒温扩增RDA技术结合，检测COVID-19的方法。利用人工合成的COVID-19病毒RNA片段，能够在20-200aM范围内（每微升输入10-100个拷贝），检测到COVID-19靶序列。该测试可以从患者样本中纯化的RNA开始进行，就像用于qRT PCR分析的一样，可以在不到一小时内用试纸读出，而不需要精密仪器。 SHERLOCK COVID-19检测方案分三步工作，像qRT-PCR一样，从核酸提取开始，可在1小时内完成。 实验步骤（1）–25分钟孵育–使用重组酶聚合酶扩增（Magigen RDA or TwistDx RPA）试剂盒恒温扩增提取核酸样品； （2）–孵育30分钟–使用CRISPR Cas13检测预扩增的病毒RNA序列； （3）–2分钟孵育–使用Magigen CRISPR产物侧向层析试纸条目测读出检测结果。 以下部分详细介绍了所需的试剂以及步骤。 B、实验要求 为了检测标本核酸提取液中是否存在COVID-19病毒RNA，在COVID-19基因组的S基因和Orf1ab基因中选择两个靶点。设计RPA扩增引物和LwaCas13a蛋白CRISPR向导RNA进行特异性检测。为了**限度地提高检测的特异性，要对靶标序列进行选择，最小化脱靶效应。 利用合成COVID-19的S基因和Orf1ab基因RNA片段, 连续稀释，能够检测到每微升10-100个拷贝的合成COVID-19病毒RNA序列。下面是不同输入浓度的侧向层析试纸条读数的示例图像：
C.材料和试剂 样本和核酸提取： 应根据适当的生物安全程序采集患者样本。本实验使用的CRISPR Cas13蛋白和恒温扩增试剂，大家可以采购市面上的商品，例如TwistDX, Magigen,NEB,IDT,ThermoFisher赛默飞等产品。 从步骤（1）开始，该方案的输入可以是与qRT-PCR分析中使用的相同的提取核酸。 试剂： 对于步骤（1）等温放大： - TwistAmp® Basic (TABAS03KIT), TwistDx or Magigen RDA-Basic - ProtoScript® II Reverse Transcriptase(M0368L), NEB or Magicscript Reverse Transcriptase (RTase) II，逆转录酶，RT酶 - RPA Amplification primer pairtargeting S gene (S-RPA-Forward_v1: 5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGA-3’; S-RPA-Reverse_v1: 5’-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’), 可以从IDT或者Magigen购买 -靶向Orf1ab的RPA扩增引物对 (Orf1ab-RPA-Forward_v1: 5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCGAAGTTGTAGGAGACATTATACTTAAACC-3’; Orf1ab-RPA-Reverse_v1: 5’-TAGTAAGACTAGAATTGTCTACATAAGCAGC-3’) 对于步骤（2），使用CRISPR Cas13蛋白检测病毒RNA： -切割缓冲液(400mM Tris pH 7.4 in ddH2O). 预制，可采用1M Tris pH 7.4 stock solution from SigmaAldrich (T2194-100ML) - SUPERase•In™ RNase Inhibitor (AM2694),ThermoFisher Scientific - NxGen® T7 RNA Polymerase (30223-1),Lucigen - Ribonucleotide Solution Set (N0450S),NEB - Magnesium chloride solution (63069-100ML),Sigma Aldrich - Storage Buffer for diluting Cas13protein stock (combine 2.5 mL of 1M Tris pH 7.4, 6 mL of 5M NaCl, 2.5 mL ofglycerol, and 100 μL of 1M DTT, and 38.9 mL ddH2O) - 纯化CRISPR LwaCas13a蛋白 accordingto Kellner et al., Nature Protocols 2019, stored as 4ul aliquots at 2mg/mL. 可采用Magigen Cas13a蛋白。 - CRISPR LwaCas13a crRNA for detecting S gene(S-crRNA_v1: 5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3’), 可以从Magigen或者Synthego购买 - CRISPR LwaCas13a crRNA for detecting Orf1ab gene(Orf1ab-crRNA_v1: 5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCAACCUCUUCUGUAAUUUUUAAACUAU-3’) - Reporter RNA for lateral flow read out(Lateral-Flow-Reporter: 5’-/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3’) For Step (3) reading out using lateral flowdipstick: - HybriDetect Dipstick (MGHD 1), MileniaBiotec GmbH Positive control sequences (can be produced using T7 transcription from synthesized DNA oligos): - S gene fragment: 5’-UAACAUCACUAGGUUUCAAACUUUACUUGCUUUACAUAGAAGUUAUUUGACUCCUGGUGAUUCUUCUUCAGGUUGGACAGCUGGUGCUGCAGCUUAUUAUGUGGGUUAUCUUCAACCUAGGACUUUUCUAUUAAAAUAUAAUGAAAAUGGAACCAUUACAGAUGCUGUAGACUGUGC-3’ - Orf1ab gene fragment: 5’-UGAGUGUAAUGUGAAAACUACCGAAGUUGUAGGAGACAUUAUACUUAAACCAGCAAAUAAUAGUUUAAAAAUUACAGAAGAGGUUGGCCACACAGAUCUAAUGGCUGCUUAUGUAGACAAUUCUAGUCUUACUAUUAAGAAACCUAAUGAAUUAUCUAG-3’ 设备： -37°C水浴锅 -42°C水浴锅 -用于旋转1.5mL试管的微型离心机 D、实验方案 ***重要提示：为防止样品污染混淆检测结果，应使用两个不同的工作区域执行步骤（1）和（2）。 步骤（1）应在预扩增区域进行，对污染特别敏感。放大后的样品不应在步骤（1）的工作区域打开。设立一个单独的区域用于扩增后反应，用于执行方案的步骤（2）。孵育后，步骤（1）的反应只能在扩增后区域打开。 另外，仅在扩增后区域中进行步骤（3）的反应。 ***重要提示：在指定温度孵育前，所有反应要在冰上进行。 步骤（1）-等温扩增，在扩增前工作区域进行： 为了测试每个样品，设置两个RPA反应，分别用于检测S基因靶标和Orf1ab靶标。另外，可以使用合成的病毒片段建立S基因和Orf1ab的阳性对照。还应设置未添加测试样品的阴性对照。 使用RPA试剂盒中提供的29.5ul Rehydration再水化缓冲液重悬每个冻干的RPA沉淀。 对于S基因靶标，每个反应可以设置如下： 1. Resuspended RPA solution 5.9 ul 2. S-RPA-Forward_v1 (10 uM) 0.5 ul 3. S-RPA-Reverse_v1 (10 uM) 0.5 ul 4. ProtoScript RT (100,000U/mL) 0.2 ul 5. ddH2O 1.4 ul 6. Sample 1 ul 7. MgAc (supplied in RPA kit) 0.5 ul Total 10 ul
对于Orf1ab基因靶标，每个反应可以设置如下： 1.Resuspended RPA solution 5.9 ul 2.Orf1ab-RPA-Forward_v1 (10 uM) 0.5 ul 3.Orf1ab-RPA-Reverse_v1 (10 uM) 0.5 ul 4.ProtoScript RT (100,000U/mL) 0.2 ul 5.ddH2O 1.4 ul 6.Sample 1 ul 7.MgAc (supplied in RPA kit) 0.5 ul Total 10 ul
充分混合，并在预热的42℃水浴锅中孵育每个反应25分钟。温育后，立即将反应物放回冰上，直到准备好，添加到步骤（2）的反应中。 步骤（2）-使用Cas13检测病毒RNA序列 取一份等份的CRISPR LwaCas13a蛋白（2mg/mL，4ul），用122.5ul储存缓冲液重悬。 对于每个S基因RPA反应，按照如下要求建立CRISPR-Cas13检测反应： 1.Cleavage Buffer (400mM Tris pH 7.4) 2 ul 2.ddH2O 9.6 ul 3.LwaCas13a蛋白 (resuspended) 2 ul 4.S-crRNA_v1 (10 ng/ul) 1 ul 5.Lateral-Flow-Reporter (20 uM) 1 ul 6.SUPERase•In RNase Inhibitor 1 ul 7.Lucigen T7 Polymerase 0.6 ul 8.Ribonucleotide Solution 0.8 ul 9.MgCl2 (120mM) 1 ul 10.RPA reaction from Step (1) 1 ul Total 20 ul
对于每个Orf1ab基因RPA反应，按下列条件建立CRISPR-Cas13检测反应： 1. Cleavage Buffer (400mM Tris pH 7.4) 2 ul 2. ddH2O 9.6 ul 3. LwaCas13a protein (resuspended) 2 ul 4. Orf1ab-crRNA_v1 (10 ng/ul) 1 ul 5. Lateral-Flow-Reporter (20 uM) 1 ul 6. SUPERase•In RNase Inhibitor 1 ul 7. Lucigen T7 Polymerase 0.6 ul 8. Ribonucleotide Solution 0.8 ul 9. MgCl2 (120mM) 1 ul 10. RPA reaction from Step (1) 1 ul Total 20 ul 设置好所有反应后，摇晃充分混合，在离心机中旋转，并在预热37℃水浴锅中培养30分钟。孵育后，将反应管放回冰上，继续进行步骤（3），读取侧向层析试纸条结果。 步骤（3）–通过侧向层析试纸条目视读出检测结果 在步骤（2）后，向每个20ul反应中加入80ul HybriDetect测定缓冲液，并充分混合。将稀释的反应物置于室温的管架中。 将HybriDetect检测试纸条放入每个反应管中，等待反应流过试纸。 阳性对照样品应显示两行，阴性对照样品应仅显示底线。 对于每个测试样品，检查S和Orf1ab基因是否都出现两条线，如果是，就表明COVID-19阳性结果。 E. 实验说明 本文提供的参数、说明仅供参考，实验人员可以根据自己的需要调整材料、配置，实现自己的目标。 相关阅读 A CRISPR Cas13 protocol for detection of COVID-19基于CRISPR Cas13a的快速、简易核酸检测CREST CRISPR Cas13a结合恒温扩增技术进行病毒检测与实战验证 脑洞大开，用CRISPR CAS13A喷雾治疗流感和新冠病毒 从CRISPR Cas13开始: Crispr Cas13蛋白的作用与用途 |
